Norma din 2004 de aplicare a metodelor de analiză chimică, fizică, microbiologică şi de evaluare senzorială a laptelui şi produselor lactate şi descrierea unora dintre metodele respective
M.Of. 421 bis
În vigoare Versiune de la: 1 Ianuarie 2006
Norma din 2004 de aplicare a metodelor de analiză chimică, fizică, microbiologică şi de evaluare senzorială a laptelui şi produselor lactate şi descrierea unora dintre metodele respective
Dată act: 26-ian-2004
Emitent: Ministerul Agriculturii, Padurilor, Apelor si Mediului
CAPITOLUL I:PREVEDERI GENERALE
SECŢIUNEA 1:Obiect şi domeniu de aplicare
Art. 1
Prezentele norme stabilesc modul de aplicare a metodelor de analiză chimică, fizică, microbiologică şi de evaluare senzorială a laptelui şi produselor lactate care urmează să fie folosite în cadrul aranjamentelor prevăzute în organizarea comună a pieţei laptelui şi produselor lactate. De asemenea, se descriu unele dintre metodele respective.
SECŢIUNEA 2:Lista metodelor
Art. 2
- Anexa 1 la prezentele norme stabileşte lista metodelor de referinţă aplicabile analizelor menţionate în art. 1. Această listă se actualizează ori de câte ori este necesar.
SECŢIUNEA 3:Metodele de rutină
Art. 3
(1)Metodele de rutină pot fi folosite pentru analizele necesare conform normelor comunitare, cu condiţia să fie ajustate în mod adecvat şi verificate cu regularitate pe baza metodei de referinţă.
(2)Pentru verificarea rezultatelor obţinute prin metodele de rutină care sunt aproape de limitele descrise în metodele de referinţă se poate aplica procedura descrisă în anexa II.
(3)În cazul unor contestaţii, rezultatele obţinute prin metoda de referinţă sunt hotărâtoare.
SECŢIUNEA 4:Validarea metodelor de referinţă
Art. 4
(1)Metodele de referinţă sunt validate dacă îndeplinesc criteriile de precizie prestabilite privind limita de repetabilitate şi reproductibilitate.
(2)Dacă o metodă de referinţă prevăzută în prezentele norme nu a fost validată, Laboratorul naţional de referinţă pentru analiza şi testarea laptelui şi a produselor pe bază de lapte, va stabili o limită orientativă de reproductibilitate.
(3)Limita menţionată trebuie obţinută conform procedurii descrise în anexa III (b). Cu toate acestea, pe parcursul primelor 18 luni de la intrarea în vigoare a prezentelor norme, se poate folosi o procedură echivalentă. Respectarea limitei este verificată cel puţin o dată pe an.
(4)Dacă rezultatele obţinute în urma aplicării metodelor de referinţă validate sau a metodelor cu cifre orientative privind precizia arată că a fost depăşită o limită, rezultatele analitice pot fi evaluate prin metoda descrisă în anexa IV pentru a se determina diferenţa critică faţă de limita în cauză.
SECŢIUNEA 5:Admisibilitatea rezultatelor analizelor
Art. 5
(1)Analizele se realizează în laboratoare în care există o procedură internă de control al calităţii conformă cu cea descrisă în anexa V lit. (a) sau o procedură cu standard echivalent. Descrierea detaliată a procedurii aplicate trebuie să fie disponibilă pentru consultare în laborator.
(2)Laboratoarele îşi stabilesc precizia proprie pentru toate metodele urmând:
a)procedura descrisă în anexa V lit. (b), sau
b)o procedură validată publicată cu repetabilitate stabilită.
(3)Conformarea la limita de reproductibilitate trebuie verificată cel puţin o dată pe an folosindu-se procedura descrisă în anexa III lit. (a).
(4)Alineatul (2) nu se aplică laboratoarelor care au participat la un program de testare a competenţei pe parcursul anului.
(5)Rapoartele de laborator privind rezultatele analizelor trebuie să conţină suficiente informaţii pentru a se putea realiza o evaluare a rezultatelor conform anexei IV şi anexei VIII.
(6)Rezultatele analizei se consideră admisibile dacă au fost obţinute conform criteriilor de admisibilitate descrise în procedura de control intern al calităţii menţionată în alin. (1) şi cu precizia internă menţionată în alin. (2).
SECŢIUNEA 6:Evaluarea senzorială
Art. 6
(1)Pentru unt se aplică procedurile descrise în anexa VI pentru verificarea performanţei evaluatorilor şi a preciziei rezultatelor. Procedura descrisă în anexa VII se aplică ca metodă de referinţă pentru evaluarea senzorială.
(2)Pentru lapte şi produse lactate altele decât untul, metoda de referinţă care trebuie folosită de către laboratoare pentru evaluarea senzorială este fie standardul FIL 99C/1997, fie alte metode comparabile pe care acestea le notifică Laboratorului naţional de referinţă pentru analiza şi testarea laptelui şi a produselor pe bază de lapte.
(3)Procedurile descrise în anexa VI pot fi folosite pentru verificarea performanţei evaluatorilor şi a preciziei rezultatelor.
SECŢIUNEA 7:Prelevarea de probe şi contestarea rezultatelor analizelor
Art. 7
(1)Pentru analizele obligatorii conform regulilor comunitare se prelevează probe martor.
(2)Procedura descrisă în anexa VIII se foloseşte în cazurile în care rezultatele unei analize nu sunt acceptate de către agentul economic.
CAPITOLUL II:METODE DE ANALIZĂ
SECŢIUNEA 8:Conţinutul de apă/substanţă uscată negrasă/grăsime al untului
Art. 8
(1)Metoda de analiză descrisă în anexa IX se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea conţinutului de apă al untului.
(2)Metoda de analiză descrisă în anexa X se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea conţinutului de substanţă uscată negrasă al untului.
(3)Metoda de analiză descrisă în anexa XI se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea conţinutului de grăsime al untului.
SECŢIUNEA 9:Marcatori
Art. 9
(1)Metoda de analiză descrisă în anexa XII se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea vanilinei în untul concentrat, unt şi smântână.
(2)Metoda de analiză descrisă în anexa XIII se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea conţinutului de ester etilic al acidului beta-apo-8' carotenic în untul concentrat şi în unt.
(3)Metoda de analiză descrisă în anexa XIV se foloseşte ca metodă de referinţă pentru determinarea conţinutului de sitosterol şi stigmasterol în unt şi în untul concentrat.
(4)Untul concentrat, untul şi smântâna au fost marcate în conformitate cu normele comunitare relevante, dacă rezultatele obţinute sunt conforme cu specificaţiile din alin. (8) din anexele menţionate în alin. (1), (2) sau (3).
SECŢIUNEA 10:Detectarea cazeinei din lapte de vacă
Art. 10
Metoda de analiză pentru detectarea cazeinei din lapte de vacă este descrisă în Ordinul comun MAAP, MSF nr. 555/1.020/2002 şi ANPC nr. 1/2003 pentru aprobarea metodei de analiză de referinţă pentru detectarea laptelui de vacă şi a cazeinaţilor din lapte de vacă în brânzeturile fabricate din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliţă sau din amestecul acestora, publicată în Monitorul Oficial al României nr. 236 din 7 aprilie 2003.
SECŢIUNEA 11:Detectarea bacteriilor coliforme
Art. 11
(1)Metoda de referinţă pentru analiză descrisă în anexa XV se foloseşte pentru detectarea prezenţei bacteriilor coliforme în unt, lapte praf degresat, cazeină şi cazeinaţi.
(2)Se pot folosi metodele de rutină pentru detectarea bacteriilor coliforme cu condiţia ca rezultatele obţinute să fie comparabile cu cele obţinute prin metoda de referinţă descrisă în anexa mai sus menţionată. Este foarte important ca metodele de referinţă să aibă o limită de detecţie adecvată. Nu trebuie să apară rezultate fals negative. Dacă nu se poate elimina apariţia rezultatelor fals pozitive, orice rezultat pozitiv trebuie confirmat prin metoda de referinţă.
SECŢIUNEA 12:Conţinutul de lactoză
Art. 12
Metoda de determinare a conţinutului de lactoză, al produselor care intră sub incidenţa codului NC 2309 din nomenclatura combinată a sistemului armonizat de codificare şi descriere a mărfurilor, este descrisă în anexa XVI.
SECŢIUNEA 13:Detectarea zerului obţinut de la închegarea cu cheag a brânzeturilor
Art. 13
(1)Metoda de detectare a zerului obţinut de la închegarea cu cheag a brânzeturilor în laptele praf degresat destinat depozitării publice este descrisă în anexa XVII.
(2)Metoda de detectare a zerului obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor în laptele praf degresat şi în amestecurile destinate utilizării ca furaje pentru animale este descrisă în anexa XVIII.
SECŢIUNEA 15:Reziduuri antimicrobiotice
Art. 15
Metoda de detectare a reziduurilor de antibiotice şi sulfamide/dapson în laptele praf degresat este descrisă în anexa XX.
SECŢIUNEA 16:Conţinutul de lapte praf degresat
Art. 16
Metoda de determinare a conţinutului de lapte praf degresat din furajele combinate este descrisă în anexa XXI.
SECŢIUNEA 17:Detectarea amidonului
Art. 17
Metoda de detectare a amidonului în laptele praf degresat, în laptele praf denaturat şi în furajele combinate este descrisă în anexa XXII.
SECŢIUNEA 18:Conţinutul de umiditate al zarei praf acide
Art. 18
Metoda de determinare a conţinutului de umiditate al zarei praf acide destinate utilizării în furaje este descrisă în anexa XXIII.
SECŢIUNEA 19:Detectarea grăsimilor străine
Art. 19
Metoda de detectare a grăsimilor, altele decât cele provenite din lapte, în lapte şi produse lactate este descrisă în anexa XXIV.
CAPITOLUL III:DISPOZIŢII FINALE
ANEXA Nr. I:LISTA METODELOR DE REFERINŢĂ
Index:
Min. = minimum, Max. = maximum, Anexă = anexa la regulamentul menţionat mai sus, SUN = substanţă uscată negrasă, AGL = acizi graşi liberi, PV = valoarea peroxidului, A = aspect, C = consistenţă, NTB = număr total de bacterii, Therm = număr de bacterii termofile, SM = stat membru, FIL = Federaţia Internaţională a Lactatelor, ISO = Organizaţia Internaţională de Standardizare, UICPA = Uniunea Internaţională pentru Chimie Pură şi Aplicată, ADPI = Institutul American pentru Produse Lactate, LCI = lapte concentrat îndulcit, LSC = lapte sau smântână concentrate, SUNL = substanţă uscată negrasă lactată (conţinută în lapte), LPD = lapte praf degresat
PARTEA A
Regulamentul Comisiei | Produsul | Parametrul | Limita | Metoda de referinţă | Observaţii |
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 | Unt fără sare | Grăsime din lapte | 82% Min. | Anexa XI | |
Depozitare publică | Apă | Până la 16% | Anexa IX | ||
(JO L 333, 24.12.1999, p. 11) | SUN | Până la 2% | Anexa X | ||
AGL (Max.) | 1,2 mmol/100 g grăsime | Standardul FIL 6B:1989 | |||
PV (Max.) | 0,3 mechiv. oxigen/1000 g grăsime | Standardul FIL 74A:1991 (versiunea în limba engleză) | Obs. 1 | ||
Bacterii coli forme | Nedetectabile în 1 g | Anexa XVII | Obs. 3 | ||
Grăsime care nu provine din lapte | Nedetectabilă prin anali za trigliceridelor | Anexa XXVI | |||
Marcatori de steroli | Nedetectabili | Anexa XVI | |||
Alţi marcatori: | |||||
- vanilină | Nedetectabilă | Anexa XII | |||
- etil esterul acidului carotenic | Nedetectabil | Anexa XIII | |||
- trigliceridele acidului enantic | Nedetectabile | UICPA 2.301 sub 5 | |||
Caracteristici de sensibilitate | Cel puţin 4 din 5 puncte pentru A, G, C | Anexa VII | |||
Dispersia apei | Cel puţin 4 puncte | Standardul FIL 112A:1989 | |||
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 | Unt fără sare | Grăsime din lapte | 82% Min. | Anexa XI | Obs. 6 |
Depozitare privată | Apă | Până la 16% | Anexa IX | ||
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 | Unt sărat | Grăsime din lapte | 80% Min. | Anexa XI | Obs. 6 |
Depozitare privată | Apă | Până la 16% | Anexa IX | ||
Sare | Până la 2% | Standardul FIL 12B:1988 Page 3 | |||
Regulamentul (CE) nr. 2571/97 | Unt fără sare | Grăsime din lapte | 80% Min. | Anexa XI | |
(JO L 350, 20.12.1997, p. 3) | Apă | Până la 16% | Anexa IX | ||
Marcatori: | 1 | ||||
1 | - steroli | Anexa XIV | |||
1 | - vanilină | Anexa XII | |||
- etil esterul acidului carotenic | Anexa XIII 1 | ||||
- trigliceridele acidului enantic | UICPA 2.301 sub 5 | ||||
Regulamentul (EC) nr. 2571/97 | Unt sărat | Grăsime din lapte | 80% Min. | Anexa XI | |
Apă | Până la 16% | Anexa IX | |||
Sare | Până la 2% | Standardul FIL 12B:1988 | |||
Marcatori: | |||||
- steroli | Anexa XIV | ||||
- vanilină | Anexa XII | ||||
- etil esterul acidului carotenic | Anexa XIII | ||||
- trigliceridele acidului enantic | UICPA 2.301 sub 5 | ||||
Regulamentul (CE) nr. 2571/97 | Unt concentrat | Grăsime din lapte | 99,8% Min. | Standardul FIL 24:1964 | |
Umiditate şi SUNL | Până la 0,2% | FIL 23A:1988 (umiditate) | |||
FIL 24:1964 (SUNL) | |||||
AGL | Până la 0,35% (oleic) | Standardul FIL 6B:1989 | |||
PV (Max.) | 0,5 mechiv. oxigen/1000 g grăsime | Standardul FIL 74A:1991 (versiunea în limba engleză) | Obs. 1 | ||
Grăsime care nu provine din lapte | Absentă | Anexa XXV | |||
Aromă | Proaspătă | ||||
Miros | Fără mirosuri străine | ||||
Altele | Absenţa agenţilor de neutralizare, a antioxidanţilor şi conservanţilor | ||||
Marcatori: | |||||
- steroli | Anexa XIV | ||||
- vanilină | Anexa XII | ||||
- etil esterul acidului carotenoic | Anexa XIII | ||||
- trigliceridele acidului enantic | UICPA 2.301 sub 5 | ||||
Regulamentul (CE) nr. 2571/97 | Smântână | Grăsime | 35% | Standardul FIL 16C:1987 Page 4 | |
Marcatori: | |||||
- steroli | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | |||
- vanilină | Anexa XII | ||||
- etil esterul acidului carotenic | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | |||
- trigliceridele acidului enantic | UICPA 2.301 sub 5 | ||||
Regulamentul (CEE) nr. 429/90 | Unt concentrat | Grăsime din lapte | 96% Min. | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 |
(JO L 45, 21.02.1990, p. 8) | SUN | Până la 2% | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | |
Marcatori: | |||||
- stigmasterol (95%) | 15 g/100 kg de unt concentrat | Anexa XIV | |||
- stigmasterol (85%) | 17 g/100 kg de unt concentrat | Anexa XIV | |||
- trigliceridele acidului enantic | 1,1 kg/100 kg de unt concentrat | UICPA 2.301 sub 5 | |||
- etil ester al acidului butiric şi stigmasterol | vezi anexa, pct. 1 lit. (c) | Anexa XIV | Obs. 2 | ||
- lecitină (E 322) | Până la 0,5% | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | ||
NaCl | Până la 0,75% | Standardul FIL 12B:1988 | |||
AGL | Până la 0,35% (oleic) | Standardul FIL 6B:1989 | |||
PV (Max.) | 0,5 mechiv. oxigen/1000 g grăsime | Standardul FIL 74A:1991 (versiunea în limba engleză) | Obs. 1 | ||
Aromă | Proaspătă | ||||
Miros | Fără mirosuri străine | ||||
Altele | Absenţa agenţilor de neutralizare, a antioxidanţilor şi conservanţilor | ||||
Regulamentul (CEE) nr. 2191/81 | Unt fără sare | Grăsime din lapte | 82% Min. | Anexa XI | |
(JO L 213, 101.08.1981, p. 20) | Apă | Până la 16% | Anexa IX | ||
Regulamentul (CEE) nr. 2191/81 | Unt sărat | Grăsime din lapte | 80% Min. | Anexa XI | |
Apă | Până la 16% | Anexa IX | |||
Sare | Până la 2% | Standardul FIL 12B:1988 | |||
Art. 9 şi pct. II al Regulamentului (CEE) nr. 1255/1999 | Brânză produsă din lapte de oaie şi/sau capră | Lapte de vacă | < 1% | Anexa XV | |
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa I - Cazeină acidă | Apă | Până la 12,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Grăsime | Până la 1,75% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Aciditate liberă | Până la 0,30% (lactic) | Standardul FIL 91:1979 | |||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa I - Cazeină cheag | Apă | Până la 12,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Grăsimi | Până la 1,00% | Standardul FIL 127A:1998 | |||
Cenuşă | 7,50% Min. | Standardul FIL 90:1979 | |||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa I - Cazeinaţi | Apă | Până la 6,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Proteine ale laptelui | 88,00% Min. | Standardul FIL 92:1979 | |||
Grăsime şi cenuşă | Până la 6,00% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Standardul FIL 89:1979 sau | |||||
Standardul FIL 90:1979 | |||||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa II - Cazeină acidă | Apă | Până la 10,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Grăsime | Până la 1,50% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Aciditate liberă | Până la 0,20% (lactic) | Standardul FIL 91:1979 | |||
NTB (Max.) | 30.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 | ||
Bacterii coli forme | Absente în 0,1 g | Anexa XVI | Obs. 3 | ||
Therm. (Max.) | 5.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 şi 4 | ||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa II - Cazeină cheag | Apă | Până la 8,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Grăsime | Până la 1,00% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Cenuşă | 7,50% Min. | Standardul FIL 90:1979 | |||
NTB (Max.) | 30.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 | ||
Bacterii coli forme | Absente în 0,1 g | Anexa XVI | Obs. 3 | ||
Therm. (Max.) | 5.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 şi 4 | ||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa II - Cazeinaţi | Apă | Până la 6,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Proteine ale laptelui | 88,00% Min. | Standardul FIL 92:1979 | |||
Grăsime şi cenuşă | Până la 6,00% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Standardul FIL 89:1979 sau 190:1979 | |||||
NTB (Max.) | 30.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 | ||
Bacterii coli forme | Absente în 0,1 g | Anexa XVI | Obs. 3 | ||
Therm. (Max.) | 5.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 şi 4 | ||
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90 | Anexa III - Cazeinaţi | Apă | Până la 6,00% | Standardul FIL 78C:1991 | |
Proteine ale laptelui | 85,00% Min. | Standardul FIL 92:1979 | |||
Grăsime | Până la 1,5% | Standardul FIL 127A:1988 | |||
Lactoză | Până la 1,00% | Standardul FIL 106:1982 | |||
Cenuşă | Până la 6,5% | Standardul FIL 89:1979 sau 190:1979 | |||
NTB (Max.) | 130.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 | ||
Bacterii coli forme | Absente în 0,1 g | Anexa XVI | Obs. 3 | ||
Therm. (Max.) | 15.000 l/g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 şi 4 | ||
Regulamentul (CEE) nr. 2799/1999 | Furaje combinate şi lapte praf degresat (LPD) (folosite în furaje) | Apă (zară praf acidă) | Până la 5% | ||
(JO L 340, 31.12.1999, p. 3) | Proteine | 31,4% (Min.) din materia uscată negrasă | Standardul FIL 20B:1993 | ||
Apă (LPD) | Până la 5% | Standardul FIL 26A:1993 | |||
Grăsimi (LPD) | Până la 11% | Standardul FIL 9C:1987 | |||
Zer închegat (LPD) | Absent | Anexa XIX | Obs. 7 | ||
Amidon (LPD) | Absent | Anexa XXIII | |||
Apă (amestecuri) | Până la 5% din materia negrasă | Standardul FIL 26A:1993 | |||
Grăsimi (amestecuri) | Directiva Comisiei 84/4/CEE (JO L 15, 18.01.1984, p. 28) | ||||
Zer închegat (amestecuri) | Absent | Anexa XIX | |||
Conţinutul LPD (din produsul final) | 50% Min. 1 | Anexa XXII | Obs. 7 | ||
Grăsimi (din produsul final) | 2,5% sau 5% Min. | Directiva Comisiei 84/4/CEE | Obs. 8 | ||
Amidon (din produsul final) | 2% Min. | Anexa XXIII | Obs. 9 | ||
Cupru (din produsul final) | 25 ppm | Directiva Comisiei 178/633/CEE (JO L 206, 26.07.1987, p. 43) | |||
Regulamentul (CE) nr. 322/96 (JO L 45, 23.02.96, p. 5) | SPM (spray) | Grăsime | Până la 1,0% | Standardul FIL 9C:1987 | |
Proteine | 31,4% (Min.) din materia uscată negrasă | Standardul FIL 20B:1993 | |||
Apă | Până la 3,5% | Standardul FIL 26A:1993 | |||
Aciditate (N/10 NaOH) | Până la 19,5 ml | Standardul FIL 86:1981 | |||
Lactaţi | Până la 150 mg/100 g | Standardul FIL 69B:1987 | |||
Fosfatază | Negativ | Standardul FIL 3356:1975 | |||
Solubilitate | Până la 0,5 ml la 24°C | Standardul FIL 129A:1988 | |||
Particule arse | Disc B Min. (15,0 mg) | ADPI:1990 | |||
NTB | 140.000/1 g | Standardul FIL 100B:1991 | Obs. 3 | ||
Bacterii coli forme | Negativ/0,1 g | Anexa XVI | Obs. 3 | ||
Zară | Negativ | Anexa XX | |||
Zer închegat | Negativ | Anexa XVIII | |||
Zer acid | Negativ | Metoda aprobată de autoritatea competentă | Obs. 2 | ||
Agenţi antimicrobieni | Anexa XXI |
PARTEA B
Metodele de referinţă enumerate în Partea B pot fi folosite pentru analiza produselor din domeniul reglementat de oricare dintre regulamentele enumerate în coloana 1.
Regulamentul Comisiei | Produsul | Codul CN | Parametrul | Limita | Metoda de referinţă | Obs. |
Regulamentul (CEE) nr. 2658/87 (JO L 256, 07.09.1987, p. 1) | Lapte şi smântână neconcentrate şi neconţinând zahăr adăugat sau alţi îndulcitori | 0401 | Grăsime (=< 6%) | Limitele sunt cele specificate în descrierea codului CN pentru produsul respectiv, specificate mai apoi după caz în Regulamentul Comisiei (CEE) nr. 3846/87 (JO L 366, 24.12.1987, p. 1) partea a 9-a din nomenclatura pentru export sau Regulamentul (CE) nr. 1374/98 (JO L 185, 30.06.1998, p. 21) | Standardul FIL 1D:1996 | |
Regulamentul (CE) nr. 2414/98 (JO L 299, 10.11.1998, p. 7) | Grăsime (> 6%) | Standardul FIL 16C:1987 | ||||
Regulamentul (CE) nr. 1374/98 (JO L 185, 30.06.1998, p. 21) | Lapte şi smântână, concentrate sau conţinând zahăr adăugat sau alţi îndulcitori | 0402 | Grăsimi (formă lichidă) | Standardul FIL 13C:1987 | ||
Regulamentul (CE) nr. 2508/97 (JO L 345, 16.12.1997, p. 31) | Grăsimi (formă solidă) | Standardul FIL 9C:1987 | ||||
Regulamentul (CE) nr. 174/1999 (JO L 20, 27.01.1999, p. 8) | Proteine | Standardul FIL 20B:1993 | ||||
Zaharoză (conţinut normal) | Standardul FIL 35A:1992 | |||||
Zaharoză (conţinut scăzut) | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | ||||
1 | Substanţă uscată (LCI) | Standardul FIL 15B:1991 | ||||
1 | Substanţă uscată (LSC) | Standardul FIL 2lB:1987 | ||||
Apă (lapte şi smântână praf) | Standardul FIL 26A:1993 | |||||
Zară, lapte sau smântână fermentate sau acidificate, concentrate sau neconcentrate, conţinând zahăr adăugat sau alţi îndulcitori | 0403 | Grăsime | Standardele FIL 1D:1996, 9C:1997, 16C:1987, 22B:1987, 126A:1988 | |||
1 | Proteine | Standardul FIL 20B:1993 | ||||
Zaharoză (conţinut normal) | Standardul FIL 35A:1992 | |||||
Zaharoză (conţinut scăzut) | Metodele aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | ||||
Apă (zară acidă praf) | Anexa XXIV | |||||
Apă (zară dulce praf) | Standardul FIL 26A:1993 | |||||
Substanţă uscată (alte produse) | Metodele aprobate de autoritatea competentă | |||||
Zer, concentrat sau nu, conţinând sau nu zahăr adăugat sau alţi îndulcitori; produse formate din constituenţi naturali ai laptelui | 0404 | Grăsime | Standardele FIL 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987 | |||
Proteine | Standardul FIL 20B:1993 | |||||
Zaharoză (conţinut normal) | Standardul FIL 35A:1992 | |||||
Zaharoză (conţinut scăzut) | Metode aprobate de autoritatea competentă | Obs. 2 | ||||
0404 90 | Proteine | Standardul FIL 20B:1993 | ||||
Apă | Standardul FIL 26A:1993 | |||||
Substanţă uscată | Standardul FIL 25B:1991 | |||||
(Produse concentrate) | Standardul FIL 21B:1987 | |||||
Unt şi alte grăsimi derivate din lapte; produse lactate tartinabile | 0405 | Grăsime (dacă =< 85%) | Anexa XI | |||
Apă | Anexa IX | |||||
Unt | SUN | Anexa X | ||||
NaCl | Standardul FIL 12B:1998 | |||||
Ulei de unt | Grăsime (dacă > 99%) | Standardul FIL 24:1964 | ||||
Apă (dacă grăsimea < 99%) | Standardul FIL 23A:1988 | |||||
Brânză şi brânză de vaci | 0406 | Grăsime | Standardul FIL 5B:1986 | |||
Substanţă uscată | Standardul FIL 4A:1982 | |||||
Substanţă uscată (Urdă) | Standardul FIL 58:1970 | |||||
NaCl | Standardul FIL 88A:1988 | |||||
Lactoză | Standardul FIL 79B:1991 | |||||
Regulamentul (CEE) nr. 2658/87 | Furaje combinate | 2309 | Lactoză | Anexa XVII | ||
Observaţii la lista metodelor de referinţă ale Uniunii Europene. Obs. 1: Izolarea grăsimii din lapte conform Standardului FIL 6B:1989 (la adăpost de lumină). Obs. 2: Nu s-a stabilit nici o metodă de referinţă. Obs. 3: Proba este preparată conform Standardului FIL 122C:1996 sau conform Standardului FIL 73A:1985. Obs. 4: Incubare timp de 48 de ore la temperatură de 55°C, acordându-se atenţie prevenirii uscării mediului de cultură. Obs. 5: % SUN = % Substanţă uscată - % grăsime. Obs. 6: Untul trebuie să corespundă clasei naţionale a calităţii producţiei statului membru la care se referă anexa V la Regulamentul Comisiei (CE) nr. 2771/1999. Obs. 7: Directiva Comisiei 84/8/CEE. Obs. 8: Regulamentul Comisiei (CE) nr. 1758/94 (JO L 183, 19.07.1994, p. 14). Obs. 9: Directiva Comisiei 78/633/CEE. | ||||||
ANEXA Nr. II:VERIFICAREA REZULTATELOR OBŢINUTE PRIN METODE DE RUTINĂ CARE SUNT APROAPE DE LIMITELE SPECIFICATE ÎN REGULAMENTELE PRIVIND CERINŢELE DE COMPOZIŢIE ŞI CALITATE
Dacă m0 este limita pentru cerinţele de compoziţie şi calitate specificate în unul dintre regulamente, limita de decizie (L) este:
L = m0
dacă R(Rout)/R(Ref) =< 1
R(Rout): Limita de reproductibilitate a metodei de rutină
R(Ref): Limita de reproductibilitate a metodei de referinţă
Dacă m0 este o limită superioară iar R(Rout/R(Ref) > 1, această limită de decizie se obţine cu ajutorul formulei
L = m0 - [(R(Rout)/R(Ref)) - 1] * CrD95
Dacă în aceleaşi condiţii, m0 este o limită inferioară, limita de decizie se obţine cu ajutorul formulei
L = m0 + [(R(Rout)/R(Ref)) - 1] * CrD95
unde CrD95 este diferenţa critică a metodei de referinţă (vezi anexa IV).
Dacă m0 este o limită superioară, rezultatele finale care se situează deasupra limitei de decizie obţinute printr-o metodă de rutină se înlocuiesc cu un rezultat final obţinut prin metoda de referinţă. Acest rezultat final trebuie să se bazeze pe cel puţin acelaşi număr de analize/probe ca şi rezultatul final obţinut prin metoda de rutină.
Dacă m0 este o limită inferioară, se urmează aceeaşi procedură pentru rezultatele finale care se situează sub limita de decizie obţinută prin metoda de rutină.
Observaţie
Procedura descrisă mai sus poate fi urmată dacă nu există efecte matriciale detectabile.
Efectele matriciale pot fi detectate în modul următor: pentru fiecare probă folosită pentru calibrare se determină diferenţa (w(i)) dintre rezultatele obţinute prin metodele de referinţă şi de rutină.
Valoarea deviaţiei standard calculată cu ajutorul formulei
m: Numărul probelor folosite pentru calibrare;
se compară cu media aritmetică a deviaţiei standard a repetabilităţii metodelor de referinţă şi de rutină
Efectul matricial nu poate fi exclus dacă
unde:
f = m (f: numărul de grade de libertate),
alfa = probabilitatea de eroare; alfa = 0,05.
În acest caz, sunt necesare investigaţii ulterioare înainte de a se putea stabili o limită de decizie.
ANEXA Nr. III:
a)Procedura de determinare a respectării unei limite de reproductibilitate stabilite (Analiză chimică)
Respectarea limitei de reproductibilitate se verifică prin compararea rezultatelor de laborator cu rezultatele obţinute într-un laborator cu acreditat utilizându-se o probă identică. În ambele laboratoare se realizează o dublă determinare iar rezultatele se evaluează cu ajutorul formulei:
unde:
CrD95: diferenţa critică (P = 0,95),
y1: media aritmetică a două rezultate obţinute în laboratorul 1,
y2: media aritmetică a două rezultate obţinute în laboratorul 2,
R: limita de reproductibilitate: se determină prin interpolare,
r: limita de repetabilitate: dacă precizia variază odată cu nivelul.
Dacă diferenţa critică este depăşită se realizează un alt experiment în decursul următoarelor două luni. Dacă rezultatele celui de-al doilea experiment nu sunt conforme cu limita de reproductibilitate, autorităţile competente iau măsurile necesare.
b)Procedura pentru obţinerea unei limite orientative de reproductibilitate (Analiza chimică)
Limita orientativă de reproductibilitate (R(prov)) se obţine cu ajutorul următoarei ecuaţii:
unde:
y1: media a două rezultate obţinute în laboratorul 1,
y2: media a două rezultate obţinute în laboratorul 2 (vezi anexa III lit. (a)),
r: limita de repetabilitate sau limita orientativă de repetabilitate.
Observaţii:
R(prov) poate fi folosită pentru calcularea diferenţelor critice (vezi anexa VI).
R(prov) se stabileşte la 2r dacă valoarea calculată pentru R(prov) este mai mică decât 2r.
Dacă valoarea calculată este mai mare decât 3r sau cu mult mai mare decât dublul valorii R rezultată din ecuaţia Horwitz*) atunci R(prov) este inacceptabil de mare şi nu poate fi folosită pentru calcularea diferenţei critice.
R(prov) se determină cel puţin o dată pe an pe baza rezultatelor obţinute în două laboratoare (vezi anexa IV).
Valoarea medie a R(prov) se utilizează la calcularea diferenţelor critice. Regulile enunţate la 2 şi 3 se aplică valorii medii a lui R(prov).
*) Ecuaţia Horwitz:
unde:
RSD(R): deviaţie standard relativă a reproductibilităţii,
c: concentraţia exprimată ca fracţie zecimală (de exemplu: 10 g/100 g = 0,1).
Bibliografie:
Peele, J. T., Horwitz, W. şi Albert, R.
J.Ass. Off. Anal. Chem.
72(5), 784-806 (1989).
Limita de reproductibilitate (valoarea lui R) se obţine din valoarea calculată a RSD(R) după cum urmează
R = 0,0283xRSD(R)
x: media aritmetică a rezultatelor obţinute
Câteva valori calculate ale RSDR (exemple)
Concentraţie - RDD(R) (%)
1 g/100 g - 4
0,01 g/100 g - 8
1 mg/1000 g - 16
Cu o concentraţie a analitului de 1 g/100 g se obţine:
R = 0,0283 * 1 * 4 = 0,11 g/100 g.
ANEXA Nr. IV:EVALUAREA REZULTATELOR ANALITICE OBŢINUTE PRIN METODE VALIDATE
Dacă rezultatul analitic arată că a fost depăşită o limită, se calculează media aritmetică a două sau mai multe rezultate. Se utilizează procedura următoare:
În cazurile în care rezultatul analitic este constituit dintr-un singur rezultat, se efectuează o a doua analiză în condiţii de repetabilitate. Dacă cele două analize nu pot fi efectuate în condiţii de repetabilitate, se efectuează încă o analiză în duplicat în condiţii de repetabilitate şi se folosesc acele rezultate pentru evaluarea respectării diferenţei critice.
Se determină valoarea absolută a diferenţei dintre media aritmetică a rezultatelor obţinute în condiţii de repetabilitate şi se determină limita. O valoare absolută a diferenţei mai mare decât diferenţa critică denotă faptul că proba supusă analizei nu îndeplineşte condiţiile.
Diferenţa critică se determină cu ajutorul următoarei formulei:
unde:
y: media aritmetică a rezultatelor obţinute,
m0: limita,
n: numărul de analize/probe.
Dacă gradul de precizie variază cu nivelul, este necesară determinarea lui r şi R prin interpolare.
În mod normal, un rezultat final raportat pentru o probă trebuie să arate că a fost respectată o limită.
Rezultatele finale
- cuprinse în intervalul m0 şi m0 + CrD95(y - m0), dacă limita este maximă;
- cuprinse în intervalul m0 şi m0 + CrD95(y - m0), dacă limita este minimă;
vor apărea deci doar în mod excepţional.
Rezultatele finale cuprinse în intervalele menţionate se acceptă doar dacă se întâlnesc nu mai mult de o dată la fiecare cinci probe supuse analizei per lot. Dacă se analizează mai puţin de cinci probe per lot, un rezultat din intervalul menţionat este acceptabil. Totuşi dacă loturile sunt oferite în mod repetat de către un producător, se respectă regula potrivit căreia din cinci probe analizate se obţine doar un rezultat cuprins în intervalul menţionat.
Dacă rezultatul final x se calculează utilizând o formulă de forma x = y1 ± y2
(de exemplu: apă + conţinutul de grăsimi Substanţă uscată nealimentare din unt pentru a calcula conţinutul de grăsime) unde y1 şi y2 sunt rezultatele finale ale unui singur tip de analiză, atunci limitele finale de repetabilitate şi de reproductibilitate r(x) şi R(x) pentru rezultatele finale x se calculează ca:
unde r1 şi r2 sunt limitele de repetabilitate iar R1 şi R2 limitele de reproductibilitate ale lui y1 şi respectiv y2.
x se compară cu limita m0 urmând regulile menţionate la 1 şi 2. Diferenţa critică se determină folosind formula:
unde x este media aritmetică a rezultatelor x(i) obţinute.
Dacă rezultatul final se calculează pe baza unei formule de forma
x = y1/y2
(de exemplu: grăsimea din conţinutul de substanţă uscată al brânzei)
unde y1 şi y2 sunt rezultatele finale ale uni singur tip de analiză, atunci limitele totale de repetabilitate şi de reproductibilitate r(x) şi R(x) se pot calcula ca:
µ1: valoare limită sau ţintă pentru y1 (exemplu: grăsime),
µ2: valoare limită sau ţintă pentru y2 (exemplu: substanţă uscată).
unde:
r1: limita de repetabilitate, y1,
r2: limita de repetabilitate, y2.
unde:
R1: limita de reproductibilitate, y1,
R2: limita de reproductibilitate, y2.
Procedurile pentru calculul lui r(x) şi R(x) pot fi aplicate doar dacă limitele relative de repetabilitate şi de reproductibilitate (r*1; r*2; R*1; R*2) sunt mai mici sau egale cu 0,15.
x se compară cu limita µ(x) urmând regulile enunţate la 1 şi 2. Diferenţa critică se determină utilizând formula:
unde x este media aritmetică a rezultatelor obţinute în ordine cronologică*).
*)Observaţie: Dacă de exemplu, se obţin rezultatele y11, y12, y21 şi y22, trebuie calculată media aritmetică a lui y11/y21 şi y12/y22.
ANEXA Nr. V:CONTROLUL INTERN
CAPITOLUL 1:a) Procedura de control intern al calităţii (IQC) (analiză chimică)
(1)Definiţia materialului de control
Materialul folosit în scopul IQC este supus aceleiaşi, sau unei părţi a aceleiaşi proceduri ca şi materialele analizate.
Materialul de control poate fi:
- material de referinţă autorizat.
- material de referinţă intern.
- material validat printr-un test inter-laboratoare.
- material întărit.
Procedura de stabilire a IQC
Laboratorul introduce IQC urmând procedura descrisă în documentul UICPA "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control în analytical laboratories" (Linii directoare armonizate pentru controlul intern al calităţii în laboratoarele analitice)1).
1)M. Thompson şi R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" (Chimie pură şi aplicată) 67 (4), 649-666 (1995).
IQC presupune includerea materialelor de control în ciclul de analiză sau repetarea analizei probei analizate. Materialele de control trebuie să aibă o compoziţie chimică similară cu cea a probelor şi să aibă o stabilitate corespunzătoare pe parcursul perioadei respective. Trebuie să se demonstreze că ele pot fi împărţite în mod corespunzător în cantităţi identice spre a fi analizate şi au o concentraţie a analitului adecvată intervalului în cauză.
Materialul de control este introdus cel puţin o dată în fiecare ciclu analitic iar valoarea obţinută se reprezintă pe un grafic de control în vederea măsurării erorilor pe termen lung. În plus, laboratorul trebuie să demonstreze periodic respectarea condiţiilor de repetabilitate în cadrul ciclului. Acest lucru se poate realiza prin analize ale probei martor şi/sau a materialelor de analiză în duplicat. Rezultatele acestor analize se compară cu orice limite de repetabilitate publicate şi cu orice date existente despre precizia internă.
Dacă se folosesc materiale de control, valorile obţinute pentru analiza dintre cicluri a materialelor de control se reprezintă pe un grafic Shewhart (ISO 8258 (1991)) cu limite de control adecvate. Limitele de acţiune se fixează la
x ± 3 st,
unde st este deviaţia standard totală,
limitele de avertizare la
x ± 2 st
Deviaţie standard totală:
în care:
s(b): deviaţia standard dintre cicluri,
s(w): deviaţia standard în interiorul ciclului,
n: numărul de determinări.
În cazul în care nu se folosesc materiale de control (de exemplu din cauza lipsei de stabilitate), cel puţin unul dintre materialele testate se analizează în duplicat în fiecare ciclu.
Diferenţa absolută obţinută din analizele în duplicat dintr-un ciclu (vezi anexa III) se reprezintă grafic. Linia de bază este 1,128 s(w), limita inferioară este 0, limita superioară (limita de acţiune) este 3,3686 s(w), unde s(w) este deviaţia standard în interiorul titlului.
Procedura de control include materiale de nivel înalt şi scăzut când gama concentraţiilor este mare.
Dacă materialele de analiză acoperă o gamă largă de concentraţii ale analitului, laboratorul stabileşte relaţia dintre precizie şi nivel. Dacă precizia este proporţională cu nivelul, controlul ulterior se bazează pe precizie relativă (adică diferenţa absolută ca procent din valoarea medie).
(2)Apariţia unei situaţii care nu poate fi controlată în sistemul de analiză este semnalată în următoarele cazuri:
A.valoarea reprezentată în momentul respectiv iese din limitele de acţiune,
B.valoarea din momentul respectiv şi valoarea precedentă depăşesc limitele de avertizare dar se menţin între limitele de acţiune,
C.dacă se folosesc materiale de control, nouă valori succesive sunt situate de aceeaşi parte a liniei medii.
(3)Laboratorul acţionează în cazul unei situaţii care nu poate fi controlată prin:
A.oprirea analizelor în aşteptarea testelor de diagnostic şi a acţiunilor de remediere, şi
B.respingerea ciclului de rezultate şi reanalizarea materialelor de analiză.
CAPITOLUL 2:b) Procedură pentru selectarea materialului intern de control şi determinarea limitelor interne de precizie (analiză chimică)
Date privind precizia laboratorului pot fi obţinute prin repetarea analizei materialelor de control şi/sau prin repetarea analizei probelor.
Laboratoarele folosesc următoarea procedură pentru a stabili parametri de precizie pentru variaţia dintre cicluri şi în interiorul ciclului pentru uz ulterior în întocmirea graficelor de control. Laboratoarele pot adopta proceduri alternative cu condiţia să poată demonstra în mod adecvat că datele rezultate sunt de o precizie corespunzătoare.
1.Selecţia materialelor de control
Dacă este cazul ca laboratorul să folosească material de control, se colectează mai întâi datele necesare pentru a se stabili limite. Dacă este posibil, se folosesc materiale de referinţă certificate (MRC). Materialele de control propuse se analizează în condiţii de repetabilitate în cadrul unui ciclu incluzând MRC potrivite, cu repetarea analizelor şi cu randomizare. Dacă această abordare nu este posibilă, laboratoarele caută să susţină teste de competenţă şi să stabilească mijloace asupra cărora s-a ajuns la un consens (cu valori stabilite) care pot fi considerate un adevărat mijloc convenţional căruia îi poate fi atribuită o nesiguranţă adecvată. Alte proceduri includ atribuirea valorii reale prin formularea sau utilizarea materialelor de control dopate.
În plus, dacă laboratorul desfăşoară în mod regulat astfel de analize şi a instituit deja controlul statistic, orice material nou de control (de exemplu solicitat din cauza epuizării stocurilor) se obţine în raport cu analizele în desfăşurare pentru care se folosesc materialele existente.
2.Atribuirea limitelor
După selectarea materialului de control, laboratorul îl foloseşte pentru a stabili cifrele de precizie dintre cicluri şi în interiorul ciclului.
Ca cerinţă minimă pentru stabilirea preciziei în interiorul ciclului, analiza materialului de control se realizează în duplicat de 12 ori. Analiza în duplicat se efectuează în condiţii de repetabilitate, adică de către acelaşi operator, cu aceiaşi reactivi etc. Analiza materialului de control în duplicat se randomizează în cadru unui ciclu de analiză. Fiecare analiză în duplicat se realizează în zile diferite dintr-o perioadă de timp pentru a se stabili variaţia rezonabilă de la un ciclu la altul, luând în considerare variaţiile normale, de exemplu reactivii, recalibrarea instrumentelor şi dacă este cazul, operatorii diferiţi.
Observaţie: Utilizarea datelor care nu sunt total reprezentative pentru variaţia dintre cicluri pot duce la repetarea inutilă a analizei din cauza limitelor foarte stricte care au fost stabilite. Dimpotrivă, este de aşteptat ca un laborator în care datele de precizie care sunt prea imprecise să nu poată face faţă limitelor prevăzute în metodele de referinţă, performanţa sa fiind slabă în comparaţie cu cea a laboratoarelor de acelaşi tip iar datele rezultate nefiind adecvate scopului căruia îi sunt destinate.
2.1.Determinarea preciziei în interiorul ciclului
2.1.1.Precizia în interiorul ciclului dacă este disponibil un material de control
Datele în duplicat (minimum 12 duplicate) trebuie mai întâi supuse la testului Cochran pentru gradul maxim de libertate. Aceasta implică compararea pătratului seriei maxime de duplicate cu suma pătratelor seriilor.
unde:
d(i) = diferenţa dintre duplicate.
Valoarea criteriului lui Cochran, C, este comparată cu valorile tabelare (ISO 5725 (1994)). Dacă o valoare poate fi clasificată ca fiind o valoare minimă sau maximă excepţională rezultalul trebuie investigat pentru a se găsi o explicaţie, de exemplu o eroare tehnică, o greşeală de calcul, o scăpare în realizarea testului, analiza unei alte probe. Dacă explicaţia erorii tehnice dovedeşte că înlocuirea rezultatului suspect este imposibilă, acesta este înlăturat, fiind considerat o valoare maximă excepţională reală. Dacă rămân cazuri neexplicate, de valori minime sau maxime excepţionale, valorile minime excepţionale sunt reţinute ca fiind corecte, iar valorile statistice maxime excepţionale sunt înlăturate. Laboratorul trebuie să încerce să obţină valori care să le înlocuiască pe acestea.
De îndată ce laboratorul s-a asigurat că datele nu cuprind valori maxime excepţionale, deviaţia standard în interiorul ciclului s(w), se obţine după cum urmează:
pentru fiecare pereche x(i1), x(i2) a datelor duplicat p, suma duplicatelor,
s(i) = x(i1) + x(i2)
şi diferenţa duplicatelor,
d(i) = x(i2) - x(i1)
sunt calculate şi însumate ca:
Limita de precizie internă este 2.8. s(w).
Dacă se utilizează o metodă de referinţă, limita de precizie internă se compară cu limita de repetabilitate publicată. Laboratorul trebuie să îndeplinească cerinţa metodei de referinţă. Neconformarea la această cerinţă trebuie investigată.
Limitele stabilite trebuie considerate provizorii şi revizuibile.
2.1.2.Precizia în interiorul ciclului dacă nu este disponibil un material de control
Laboratorul poate alege să stabilească precizia în interiorul ciclului prin analize ale probelor reprezentative în duplicat (minim 12 analize în duplicat). În cazurile în care utilizarea de materiale de control este imposibilă, de exemplu din cauza instabilităţii, se foloseşte această metodă pentru acumularea de date în duplicat.
Observaţie: Se presupune că analizele acoperă o gamă relativ restrânsă de valori şi deci se va aplica o singură valoare tuturor probelor. În cazul unei game unei game mai largi de rezultate, de exemplu deasupra unui ordin de mărime, iar precizia depinde de nivel, laboratoarele trebuie să studieze utilizarea deviaţiilor standard relative.
Datele trebuie supuse testului Cochran, ca la 2.1.1. Imediat ce laboratorul se asigură că datele nu conţin valori maxime excepţionale, se pot obţine deviaţia standard şi limita de precizie internă în interiorul ciclului ca la pct. 2.1.1.
Deviaţia standard în interiorul ciclului s(w) poate fi folosită pentru realizarea de grafice de control (vezi anexa II).
Limitele stabilite trebuie considerate provizorii şi revizuibile.
2.2.Determinarea preciziei între cicluri
Valoarea medie (s1/2) se calculează pentru fiecare pereche şi se supune la testul Grubbs [ISO 5725 (1994)]. Criteriile de respingere/acceptare a valorilor excepţionale maxime şi minime sunt descrise la 2.1.1. Laboratorul trebuie să încerce să obţină o valoare de înlocuire pentru orice rezultat care a fost înlăturat. După ce laboratorul se asigură că datele nu conţin valori excepţionale minime şi maxime, se calculează deviaţia standard în interiorul ciclului s(b).
sau 0 dacă expresia de sub semnul radical este negativă.
Deviaţia standard totală s(t) se foloseşte pentru realizarea de grafice de control pentru media de n determinări (vezi anexa II).
Limitele stabilite trebuie considerate provizorii şi revizuibile.
2.3.Revizuirea limitelor iniţiale
Limitele de control stabilite după cum s-a arătat mai sus sunt considerate estimări iniţiale. Pentru actualizarea limitelor stabilite pe baza preciziei acceptabile în interiorul ciclului (pct. 2.1.2), se colectează date suplimentare în duplicat asupra probelor. Intervalul de timp dinaintea revizuirii depinde de frecvenţa analizelor. Ca linie directoare, datele se revizuiesc după obţinerea a alte 10 duplicate. Apoi toate datele se supun testului Cochran, iar limitele se restabilesc pe baza noii valori a deviaţiei standard. În baza noilor date se iau decizii asupra validităţii limitelor de control.
Şi revizuirea datelor iniţiale obţinute pentru precizia dintre cicluri depinde de frecvenţa analizelor. Ca linie directoare, după obţinerea prin analiza materialului de control a zece puncte de date, la o frecvenţă de o analiză per lot, presupunerile iniţiale privind deviaţia standard şi medie se revizuiesc.
Toate datele se supun testului Grubbs pentru valorile maxime excepţionale. Deviaţia medie şi standard se recalculează pe baza noilor date.
În plus, în această fază, laboratorul trebuie să folosească un grafic Cusum [BS S700:(1984) şi amendamentul 5480 (1987)] pentru a investiga orice probleme care pot apărea, de exemplu, îmbătrânirea reactivilor. Orice rezultat individual care nu se încadrează în limitele "Cusum V-mask" trebuie investigat.
Noile limite (deviaţia medie şi standard) trebuie supuse controalelor periodice utilizându-se tehnica Cusum. Orice indiciu că validitatea materialului de control este nesigură se investighează temeinic.
Raportarea datelor cu precizie
Laboratoarele trimit autorităţii naţionale competente următoarele informaţii:
- metoda utilizată,
- deviaţia standard în interiorul ciclului s(w), şi limita de precizie internă,
- deviaţia standard dintre cicluri s(b),
- deviaţia totală standard s(t),
- numărul total de analize implicat în obţinerea datelor de precizie.
ANEXA Nr. VI:EVALUAREA EVALUATORILOR ŞI FIABILITATEA REZULTATELOR ÎN ANALIZELE SENZORIALE
Dacă se folosesc metode de punctare se aplică următoarele proceduri (Standardul FIL 99C/1997).
a)Determinarea "indicelui de repetabilitate"
Cel puţin 10 probe sunt analizate de un evaluator ca duplicat probă martor într-o perioadă de 12 luni. Această procedură se realizează de obicei în câteva şedinţe. Rezultatele pentru caracteristicile produsului individual sunt evaluate utilizându-se formula:
unde:
w1: indice de repetabilitate
x(i1): punctajul pentru prima evaluare a probei x(i)
x(i2): punctajul pentru a doua evaluare a probei x(i)
n: numărul de probe
Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. w1 nu trebuie să depăşească 1,5 (pe o scară de 5 puncte).
b)Determinarea "indicelui de deviaţie"
Acest indice trebuie utilizat pentru a se verifica dacă un evaluator utilizează aceeaşi scală pentru evaluarea calitativă ca şi un grup de evaluatori experimentaţi. Punctajul obţinut de evaluator este comparat cu media punctajelor obţinute de grupul de evaluatori.
Pentru evaluarea rezultatelor se foloseşte următoarea formulă:
unde:
x i1; xi2: vezi pct. (a);
x i1; xi2: punctajul mediu al grupului de evaluatori pentru prima respectiv a doua evaluare a probei x(i);
n: numărul de probe (cel puţin zece per 12 luni).
Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. D1 nu trebuie să depăşească 1,5 (pe scale de 5 puncte).
Statele membre notifică orice dificultăţi întâmpinate în aplicarea prezentei proceduri.
c)Compararea rezultatelor obţinute în regiuni diferite ale statelor membre şi în diferite state membre
Dacă este cazul, se organizează un test cel puţin o dată pe an pentru a compara rezultatele obţinute de evaluatorii din diferite regiuni. Dacă se constată diferenţe semnificative, se iau măsurile necesare pentru a se identifica motivele şi pentru a se obţine rezultate comparabile.
Statele membre pot organiza teste pentru a compara rezultatele obţinute de evaluatorii lor cu cele obţinute de cei ai statelor membre învecinate. Diferenţele semnificative duc la investigaţii detaliate în scopul de a se obţine rezultate comparabile.
Statele membre notifică Comisiei rezultatele acestor comparaţii.
ANEXA Nr. VII:EVALUAREA SENZORIALĂ A UNTULUI
1.Domeniul de aplicare
Scopul acestei proceduri de evaluare senzorială a untului este de a furniza o metodă uniformă aplicabilă în toate statele membre.
2.Definiţii
Evaluare senzorială înseamnă examinarea caracteristicilor unui produs cu ajutorul organelor de simţ.
Panel înseamnă un grup de evaluatori selectaţi care, pe perioada evaluării, lucrează independent, fără a comunica între ei şi fără a se influenţa reciproc.
Punctare înseamnă evaluarea senzorială realizată de un panel folosindu-se o scală numerică. Trebuie să se folosească un nomenclator al defectelor.
Clasificare înseamnă o clasificare pe categorii realizată pe baza punctării.
Documente de control: documentele folosite pentru înregistrarea punctajelor individuale pentru fiecare caracteristică şi a clasificării finale a produsului. (Acest document poate fi folosit şi pentru înregistrarea compoziţiei chimice).
3.Cameră de testare
3.1.Sunt necesare măsuri de precauţie pentru ca evaluatorii dintr-o cameră de testare să nu fie influenţaţi de factori externi.
3.2.În camera de testare nu trebuie să existe mirosuri străine şi trebuie să fie uşor de curăţat. Pereţii trebuie să aibă o culoare deschisă.
3.3.Camera de testare şi iluminarea acesteia trebuie să fie de aşa natură încât să nu afecteze proprietăţile produsului care urmează să fie punctat. Camera trebuie dotată cu un sistem adecvat de control al temperaturii.
4.Selecţia evaluatorilor
Evaluatorii trebuie să fie familiarizaţi cu produsele din unt şi să aibă competenţa necesară pentru a realiza o gradare a sensibilităţi senzoriale. Competenţa evaluatorului este evaluată de către autoritatea competentă în mod regulat (cel puţin o dată pe an).
5.Cerinţe pentru panel
Numărul evaluatorilor din panel trebuie să fie impar, numărul minim fiind de trei. Majoritatea acestora trebuie să fie angajaţi ai autorităţii competente sau persoane autorizate care nu sunt angajate în industria de prelucrare a laptelui.
Înainte de evaluare trebuie avuţi în vedere mai mulţi factori pentru obţinerea unor performanţe optime ale subiecţilor:
- subiecţii nu trebuie să sufere de boli care le-ar putea afecta performanţa. Într-un asemenea caz, evaluatorul în cauză trebuie înlocuit în panel cu un alt evaluator.
- subiecţii trebuie să se prezinte în mod punctual la evaluare şi să dispună de suficient timp pentru realizarea evaluării
- subiecţii nu trebuie folosească substanţe cu miros puternic cum sunt parfumul, loţiunea după ras, deodorantul etc. şi trebuie să evite consumul de alimente cu arome puternice (de exemplu foarte condimentate), etc.
- subiecţii nu au voie să fumeze să mănânce şi să bea altceva decât apă cu o jumătate de oră înainte de evaluare.
6.Evaluarea valorii fiecărei caracteristici
6.1.Evaluarea senzorială se realizează pentru următoarele caracteristici: aspect, consistenţă şi aromă.
Aspectul implică următoarele caracteristici: culoare, puritate vizibilă, creştere a fungilor ciupercilor şi dispersia apei. Dispersia apei se testează conform standardului FIL 112 A/1989.
Consistenţa implică următoarele caracteristici: fermitate şi tartinabilitate.
Pentru evaluarea consistenţei untului se pot aplica metode fizice. Comisia preconizează viitoarea armonizare a acestor măsuri.
Aroma implică următoarele caracteristici: gustul şi mirosul.
O deviaţie semnificativă faţă de temperatura recomandată împiedică evaluarea sigură a consistenţei şi aromei. Temperatura este extrem de importantă.
6.2.Fiecare caracteristică trebuie să facă obiectul unei evaluări senzoriale separate. Punctarea se realizează conform tabelului 1.
6.3.Uneori este adecvat ca evaluatorii să puncteze împreună, înainte de evaluare, una sau mai multe probe de referinţă în privinţa aspectului, consistenţei şi aromei, pentru a se obţine uniformitate.
6.4.Punctajul de acceptare este următorul:
Maxim | Necesar | |
Aspect | 5 | 4 |
Consistenţă | 5 | 4 |
Aromă | 5 | 4 |
În cazurile în care nu se obţine punctajul necesar trebuie să se facă o descriere a defectului.
Punctajul acordat de fiecare evaluator pentru fiecare caracteristică trebuie înregistrat în documentul de control. Produsul este acceptat sau respins pe baza deciziei majorităţii. Nu trebuie să se înregistreze în mod frecvent cazuri în care diferenţele dintre punctajele individuale acordate pentru fiecare caracteristică să fie mai mari de un punct (nu mai frecvent de un caz la 20 de probe). În caz contrar competenţa panelului trebuie verificată de conducătorul panelului.
7.Supraveghere
Conducătorul panelului, care trebuie să fie angajat oficial al autorităţii competente şi care poate fi membru al panelului trebuie să răspundă în general pentru întreaga procedură. El trebuie să înregistreze punctajele individuale pentru fiecare caracteristică în documentul de control şi să certifice dacă produsul este acceptat sau respins.
8.Prelevarea şi prepararea probei
8.1
Este de dorit ca identitatea probelor să fie ascunsă în timpul evaluării, astfel încât să se evite orice posibilitate de favorizare.
- Organizarea în acest sens este realizată de conducătorul panelului, înainte de evaluare şi fără ca vreunul dintre membrii panelului să fie de faţă.
8.2.Când evaluarea senzorială se realizează într-un antrepozit frigorific, proba este prelevată cu ajutorul unui prelevator de unt. Dacă evaluarea senzorială se realizează în alt loc decât în antrepozitul frigorific, se prelevează o probă de cel puţin 500 g.
8.3.Pe parcursul evaluării, untul trebuie să aibă o temperatură de 10 până la 12°C. Deviaţiile mari trebuie evitate cu orice preţ.
9.Nomenclator
Consultaţi tabelul 2 anexat.
Tabelul 1: Punctajul pentru unt
Aspect | Consistenţă | Miros şi aromă | ||||||
Puncte | Nr.1 | Observaţii | Puncte (clasă de calitate) | Nr.1 | Observaţii | Puncte (clasă de calitate) | Nr.1 | Observaţii |
5 | Foarte bine | 5 | Foarte bine | Foarte bine | ||||
tipul ideal | tipul ideal | tipul ideal | ||||||
cea mai bună calitate | cea mai bună calitate | cea mai bună calitate | ||||||
(substanţă uscată egală) | (bine tartinabil) | (cea mai fină aromă absolut pură) | ||||||
4 | Bine2 | Bine2 | 4 | Bine2 | ||||
Nu există defecte evidente | 4 | 17 | tare | Nu există defecte evidente | ||||
18 | moale | |||||||
3 | Acceptabil (mici defecte) | 3 | Acceptabil (mici defecte) | 3 | Acceptabil (mici defecte) | |||
1 | nelegat (necompact), umed | 14 | dezemulsionat, friabil, sfărâmicios | 21 | neclară | |||
2 | neuniform, în două culori | 15 | păstos, de consistenţa aluatului, gras | 22 | arome străine | |||
3 | cu dungi | 16 | lipicios | 25 | acid | |||
4 | pestriţ, marmorat | 17 | tare | 27 | aromă de copt, aromă de ars | |||
5 | cu aspect pătat | 18 | moale | 33 | aromă de furaj | |||
6 | separare a uleiurilor | 34 | aspru, amar | |||||
7 | supracolorat | 35 | suprasărat | |||||
8 | textură slabă, deschisă | |||||||
2 | Slab (defecte evidente) | 2 | Slab (defecte evidente) | 2 | ||||
1 | nelegat (necompact), umed | 14 | dezemulsionat, friabil, sfărâmicios | 21 | impur | |||
3 | cu dungi | 15 | păstos, de consistenţa aluatului, gras | 22 | arome străine | |||
4 | pestriţ, marmorat | 16 | lipicios | 23 | vechi | |||
5 | cu aspect granulat | 17 | tare | 25 | acid | |||
6 | separare a uleiurilor | 18 | moale | 32 | miros oxidat, miros metalic | |||
10 | materii străine | 33 | aromă de furaj | |||||
11 | mucegăit | 34 | aspru, amar | |||||
12 | sare nedizolvată | 35 | suprasărat | |||||
36 | mucegăit, putred | |||||||
38 | miros de substanţe chimice | |||||||
1 | Foarte slab (defecte mari) | 1 | Foarte slab (defecte mari) | 1 | Foarte slab (defecte mari) | |||
1 | nelegat (necompact), umed | 14 | dezemulsionat, friabil, sfărâmicios | 22 | miros străin | |||
3 | cu dungi | 15 | păstos, de consistenţa aluatului, gras | 24 | brânzos, miros de brânză lactică | |||
4 | pestriţ, marmorat | 16 | lipicios | 25 | acid | |||
5 | cu aspect pătat | 17 | tare | 26 | miros sau aromă de drojdie | |||
6 | separare a uleiurilor | 18 | moale | 28 | miros de mucegai | |||
7 | supracolorat | 29 | rânced | |||||
9 | granulat | 30 | uleios, cu gust de peşte | |||||
10 | materii străine | 31 | cu aspect/gust de seu | |||||
11 | cu fungi | 32 | miros oxidat, miros metalic | |||||
12 | sare nedizolvată | 34 | aspru, amar | |||||
36 | mucegăit, putred | |||||||
37 | cu aromă de malţ | |||||||
38 | miros de substanţe chimice | |||||||
1)Tabelul 2. 2)Defectele menţionate la "bun" reprezintă doar deviaţii foarte mici de la tipul ideal. | ||||||||
Tabelul 2: Tabelul defectelor untului
I. Aspect | |
1 | nelegat (necompact), umed |
2 | neuniform, în două culori |
3 | cu dungi |
4 | pestriţ, marmorat |
5 | pătat |
6 | separare a uleiurilor |
7 | supracolorat |
8 | textură slabă, deschisă |
9 | granulat |
10 | materii strai ne |
11 | mucegăit |
12 | sare nedizolvată |
II. Consistenţă | |
14 | dezemulsionat, friabil, sfărâmicios |
15 | păstos, de consistenţa aluatului, gras |
16 | lipicios |
17 | tare |
18 | moale |
III. | Miros şi aromă |
20 | fără miros |
21 | impur1 |
22 | arome străine |
23 | vechi |
24 | brânzos, miros de brânză lactică |
25 | acid |
26 | miros sau aromă de drojdie |
27 | a) aromă de copt b) aromă de ars |
28 | miros de mucegai |
29 | rânced |
30 | uleios, cu gust de peşte |
31 | cu aspect/gust de seu |
32 | miros oxidat, miros metalic |
33 | aromă de furaj |
34 | aspru, amar |
35 | suprasărat |
36 | mucegăit, putred |
37 | cu aromă de malţ |
38 | miros de substanţe chimice |
1)Această desemnare trebuie folosită cât mai rar posibil şi numai atunci când defectul nu poate fi descris mai exact. | |
ANEXA Nr. VIII:PROCEDURA APLICABILĂ CÂND REZULTATELE UNEI ANALIZE SUNT CONTESTATE (analiză chimică)
1.La cererea operatorului se poate realiza o analiză suplimentară în termen de şapte zile lucrătoare de la notificarea rezultatelor primei analize, cu condiţia să fie disponibile probe martor sigilate din produs care să fi fost depozitate corespunzător de autoritatea competentă.
2.Autoritatea competentă trimite aceste probe unui al doilea laborator, la cererea şi pe cheltuiala operatorului. Acest laborator trebuie să fie autorizat în vederea efectuării de analize oficiale şi trebuie să aibă competenţe dovedite în realizarea analizelor în cauză. Această competenţă trebuie documentată printr-o participare încununată de succes în studii de colaborare, teste de eficienţă sau comparaţii între laboratoare. Al doilea laborator trebuie să folosească metoda de referinţă. Rezultatele obţinute de cele două laboratoare se compară după cu urmează:
a)Dacă ambele laboratoare îndeplinesc cerinţa de repetabilitate şi cerinţa de reproductibilitate
Media aritmetică a rezultatelor testelor obţinute de ambele laboratoare este raportată ca rezultat final. Acest rezultat final este evaluat luându-se în considerare diferenţa critică, cu ajutorul următoarei formule:
unde:
y: media aritmetică a rezultatelor obţinute de ambele laboratoare,
m0: limită,
r: repetabilitate,
n1: numărul rezultatelor obţinute de laboratorul 1,
n2: numărul rezultatelor obţinute de laboratorul 2.
Observaţie: Dacă rezultatul final se calculează cu formula
x = y1 ± y2 sau x = y1/y2
(vezi anexa IV (3) şi respectiv (4)), R2(x) şi r2(x) se inserează în formulă în loc de R2 şi r2.
b)Dacă ambele laboratoare îndeplinesc cerinţa de repetabilitate dar nu şi cerinţa de reproductibilitate
Dacă a doua analiză o confirmă pe prima, cantitatea analizată este respinsă ca neconformă. În caz contrar, cantitatea este acceptată.
c)Dacă un laborator îndeplineşte cerinţa de repetabilitate
Pentru a se stabili dacă cantitatea analizată este acceptată sau nu se foloseşte rezultatul final al laboratorului care îndeplineşte cerinţa de repetabilitate.
d)Dacă nici unul dintre laboratoare nu îndeplineşte cerinţa de repetabilitate, dar este îndeplinită cerinţa de reproductibilitate. Punctul a) se aplică.
e)Dacă nici unul dintre laboratoare nu îndeplineşte nici cerinţa de repetabilitate, nici cerinţa de reproductibilitate
Cantitatea analizată este acceptată dacă rezultatele obţinute de unul dintre laboratoare conduc la această decizie.
f)Dacă rezultatele au fost obţinute prin folosirea de metode nevalidate
Cantitatea analizată este acceptată dacă rezultatele obţinute de unul dintre laboratoare conduc la această concluzie.
3.Rezultatele celei de-a doua analize trebuie notificate de către autoritatea competentă operatorului cât mai repede posibil. Costurile celei de-a doua analize sunt suportate de operator dacă cantitatea analizată este respinsă.
4.Dacă operatorul poate dovedi, în termen de cinci zile lucrătoare de la prelevarea probei, că procedura de prelevare a probelor nu a fost realizată corect, prelevarea probelor trebuie efectuată din nou dacă este posibil. Dacă prelevarea probelor nu poate fi repetată, cantitatea analizată trebuie acceptată.
ANEXA Nr. IX:DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE APĂ DIN UNT
1.Obiectul şi domeniul de aplicare
Această metodă de referinţă precizează o metodă de determinare a conţinutului de apă din unt.
2.Referinţa
Standardul FIL 50 C:1995 - Lapte şi produse lactate - Metode de prelevare a probelor
3.Definiţie
Conţinutul de apă din unt: pierderea de masă după încheierea procesului de încălzire specificat în acest standard. Se exprimă în grame la 100 de grame.
4.Principiu
Evaporarea apei din cantitatea analizată în prezenţa pietrei ponce la o temperatură de 102°C într-o etuvă.
5.Aparatură şi materiale
Aparate obişnuite de laborator, în special:
5.1.Balanţa analitică, precizie 1 mg.
5.2.Exicator prevăzut cu un agent eficient de uscare (de exemplu, silicagel proaspăt uscat cu indicator higroscopic).
5.3.Etuvă cu termostat, ventilată, funcţionând la 102 ± 2°C în întregul spaţiu de lucru.
5.4.Capsule din sticlă, porţelan sau din metale inoxidabile, cu înălţimea de aproximativ 20 mm şi diametru între 60 şi 80 mm.
5.5.Piatră ponce granulată, spălată cu diametru de 0,8 - 10 mm.
6.Prelevarea probelor
Vezi FIL 50 C:1995
7.Procedură
7.1.Prepararea probei
Se încălzeşte proba de laborator într-un recipient închis din sticlă sau dintr-un material plastic adecvat, care trebuie să fie umplut de la jumătate până la două treimi, la o temperatură la care proba este suficient de moale pentru a facilita omogenizarea ei corespunzătoare (fie cu ajutorul unui agitator mecanic, fie manual). În mod normal, temperatura de amestecare nu trebuie să depăşească 35°C. Proba se răceşte până la temperatura ambiantă. Cât mai curând posibil după răcire, se deschide recipientul care conţine proba şi se amestecă rapid (nu mai mult de 10 secunde) cu un dispozitiv adecvat, de exemplu o lingură sau o spatulă, înainte de cântărire.
7.2.Determinarea conţinutului de apă
7.2.1.Se pun în capsulă aproximativ 10 g de piatră ponce (5.4).
7.2.2.Capsula cu piatră ponce se usucă în etuvă (5,3) la 102°C timp de cel puţin o oră.
Observaţie: perioadele de uscare menţionate la 7.2.2, 7.2.5 şi 7.2.7 încep în momentul în care temperatura etuvei ajunge la 102 ± 2°C.
7.2.3.Capsula se lasă să se răcească în exicator (5.2) până ajunge la temperatura sălii de balanţe şi se cântăreşte cu precizia de 1 mg.
7.2.4.Se cântăreşte în capsulă, cu precizia de 1 mg, o cantitate pentru analiză de aproximativ 5 g din probă.
7.2.5.Capsula se pune în etuvă, la 102 ± 2°C, timp de trei ore.
7.2.6.Capsula se lasă să se răcească în exicator până ajunge la temperatura sălii de balanţe şi se cântăreşte cu precizia de 1 mg.
7.2.7.Se repetă procesul de uscare timp de aproximativ încă o oră, iar proba se răceşte şi se cântăreşte de fiecare dată după cum se arată la 7.2.6 până se obţine o masă constantă (modificarea masei mai mică de 1 mg).
În cazul în care masa creşte, se foloseşte pentru calcule cea mai mică masă înregistrată.
8.Exprimarea rezultatelor
8.1.Metoda şi formula de calcul
Conţinutul de apă, W, se calculează ca procent de masă folosindu-se următoarea formulă:
W = (m1 - m2)/(m1 - m0) x 100
unde:
m0 este masa capsulei cu piatra ponce exprimată în grame (7.2.3),
m1 este masa cantităţii analizate, a capsulei şi a pietrei ponce exprimată în grame înainte de uscare (7.2.4),
m2 este masa cantităţii analizate, a capsulei şi a pietrei ponce exprimată în grame după uscare (7.2.7).
Rezultatul se raportează cu o singură zecimală.
8.2.Repetabilitate
Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinare separate, realizate simultan sau în succesiune rapidă de către acelaşi operator, în aceleaşi condiţii şi cu material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,2%.
8.3.Reproductibilitate
Diferenţa absolută dintre două rezultate separate şi independente, obţinute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu acelaşi material de analiză nu trebuie să depăşească 0.3%.
9.Raportul de încercare
În raportul de încercare se precizează metoda folosită şi rezultatele obţinute. De asemenea, se menţionează toate detaliile de funcţionare care nu sunt specificate în acest standard internaţional sau sunt considerate opţionale, alături de detalii asupra oricăror incidente care ar fi putut influenţa rezultatele. Raportul de încercare include toate informaţiile necesare pentru identificarea completă a probei.
ANEXA Nr. X:UNT: DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE SUBSTANŢĂ USCATĂ NEGRASĂ
1.Obiect şi domeniul de aplicare
Acest standard descrie o metodă de determinare a conţinutului de substanţă uscată negrasă din unt.
2.Referinţe
Standardul FIL 50 C:1995 - Lapte şi produse lactate - Metode de prelevare a probelor.
3.Definiţii
Conţinutul de substanţă uscată negrasă al untului: procentul masic determinat prin procedura specificată. Se exprimă în grame la 100 de grame.
4.Principiu
Evaporarea apei dintr-o cantitate cunoscută de unt, extragerea grăsimilor cu eter de petrol şi cântărirea reziduului.
5.Reactiv
Eter de petrol cu temperatura de fierbere în intervalul 30 - 60°C. Reactivul nu trebuie să lase mai mult de 1 mg de reziduu după evaporarea a 100 ml.
6.Aparatură şi materiale
6.1.Balanţa analitică, precizie 1 mg.
6.2.Exicator prevăzut cu un agent eficient de uscare (de exemplu, silicagel proaspăt uscat cu indicator higroscopic).
6.3.Etuvă cu termostat, ventilată, funcţionând la 102 ± 2°C în întregul spaţiu de lucru.
6.4.Capsule din sticlă, porţelan sau din metale inoxidabile, cu înălţimea de aproximativ 20 mm şi diametru între 60 şi 80 mm, prevăzute cu baghetă de sticlă.
6.5.Creuzet de filtrare, sticlă sinterizată, diametrul porilor 16 - 40 µm, cu balon de aspiraţie.
7.Prelevarea probelor
Vezi FIL 50 C:1995
8.Procedură
8.1.Se încălzeşte proba de laborator într-un recipient închis din sticlă sau dintr-un material plastic adecvat, care trebuie să fie umplut de la jumătate până la două treimi, la o temperatură la care proba este suficient de moale pentru a facilita omogenizarea ei corespunzătoare (fie cu ajutorul unui agitator mecanic, fie manual). În mod normal, temperatura de amestecare nu trebuie să depăşească 35°C. Proba se răceşte până la temperatura ambiantă. Cât mai curând posibil după răcire, se deschide recipientul care conţine proba şi se amestecă rapid (nu mai mult de 10 secunde) cu un dispozitiv adecvat, de exemplu o lingură sau o spatulă, înainte de cântărire.
8.2.Determinarea
8.2.1.Capsula, agitatorul (6.4) şi creuzetul (6.5) se usucă în etuvă (6.3) timp de o oră. Aceste obiecte se lasă să se răcească în exicator şi se cântăresc împreună (adică capsula, bagheta şi creuzetul) cu precizia de 1 mg (m0).
Observaţie: - De regulă un timp de uscare de 45 de minute este suficient.
- Este important să se folosească aceeaşi combinaţie capsulă, baghetă, creuzet pentru fiecare cantitate analizată dacă se analizează mai multe cantităţi în lot.
8.2.2.Se îndepărtează creuzetul, se înregistrează greutatea capsulei şi a baghetei împreună, cu precizia de 1 mg (m1).
8.2.3.Se cântăreşte în capsulă, cu precizia de 1 mg, o cantitate analizată de aproximativ 5 g din probă (8.1) (m2).
8.2.4.Se introduce capsula (conţinând bagheta şi untul) în etuvă la 102 ± 2°C şi se lasă peste noapte.
8.2.5.Se lasă capsula (8.2.3) să se răcească la temperatura camerei.
8.2.6.Se adaugă 15 ml de eter de petrol cald (aproximativ 25°C) în capsulă şi se desprinde cât mai mult posibil din sedimentul lipit de capsulă, cu ajutorul baghetei. Solventul se transferă în creuzet şi se lasă să se filtreze în balonul de aspiraţie.
8.2.7.Se efectuează operaţia 8.2.6 de încă patru ori. Dacă nu există urme de grăsime pe suprafaţa vasului, se transferă cantitativ în timpul celei de-a patra spălări cât mai mult sediment posibil în creuzet. În caz contrar, se repetă operaţia 8.2.6 până la eliminarea completă a tuturor urmelor de grăsime.
8.2.8.Sedimentul din creuzet se spală cu 25 ml de eter de petrol cald.
8.2.9.Capsula, bagheta şi creuzetul se usucă împreună în etuvă la 102 ± 2°C timp de 30 minute.
8.2.10. Se lasă să se răcească în exicator până la temperatura camerei şi se cântăresc cu precizia de 1 mg.
8.2.11. Operaţiile 8.2.9 şi 8.2.10 se repetă până la o masă comună constantă (modificările masei nu depăşesc 1 mg) a capsulei, baghetei şi creuzetului (m3).
9.Exprimarea rezultatelor
9.1.Calcularea conţinutului de substanţă uscată negrasă:
Conţinutul de substanţă uscată negrasă SUN, se calculează ca procent masic folosindu-se următoarea formulă:
SUN = (m3 - m0)/(m2 - m1) x 100
unde:
m0 este masa capsulei goale cu baghetă din sticlă şi creuzet (8.2.1),
m1 este masa capsulei goale cu baghetă din sticlă exprimată în grame (8.2.2),
m2 este masa cantităţii analizate şi a capsulei cu baghetă din sticlă exprimată în grame (8.2.3),
m3 este masa finală a capsulei cu baghetă din sticlă şi creuzet conţinând sediment (8.2.11).
Rezultatul se raportează cu o singură zecimală.
9.2.Repetabilitate
Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinări separate, realizate simultan sau în succesiune rapidă de către acelaşi operator, în aceleaşi condiţii şi cu material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,1%.
9.3.Reproductibilitate
Diferenţa absolută dintre două rezultate separate şi independente, obţinute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu acelaşi material de analiză nu trebuie să depăşească 0.2%.
10.Raportul de încercare
În raportul de încercare se precizează metoda folosită şi rezultatele obţinute. De asemenea, se menţionează toate detaliile de funcţionare care nu sunt specificate în acest standard internaţional sau sunt considerate opţionale, alături de detalii asupra oricăror incidente care ar fi putut influenţa rezultatele. Raportul de încercare include toate informaţiile necesare pentru identificarea completă a probei.
Observaţie: Dacă se analizează unt sărat, sarea adăugată se determină ca substanţă uscată negrasă. Pentru determinarea conţinutului de substanţe uscată negrasă lactată, conţinutul de sare adăugată se scade din conţinutul de substanţă uscată negrasă. Cifrele calculate privind precizia determinării conţinutului de substanţă uscată negrasă lactată sunt:
Repetabilitate: r = 0,104%
Reproductibilitate: R = 0,206%
Se poate concluziona că aceste cifre privind precizia obţinute pentru determinarea substanţei uscate negrase sunt valabile pentru determinarea conţinutului de substanţă uscată negrasă lactată.
ANEXA Nr. XI:DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE GRĂSIME AL UNTULUI
Conţinutul de grăsime se obţine indirect prin determinarea conţinutului de apă şi al conţinutului de substanţă uscată negrasă conform anexei IX şi respectiv anexei X. Procentul masic de grosime este egal cu:
100 - (W + SUN)
unde:
W: este procentul masic de apă,
SUN: este procentul masic de substanţă uscată negrasă.
Cifrele calculate privind precizia determinării conţinutului de grăsime sunt:
Repetabilitate: r = 0,22%
Reproductibilitate: R = 0,36%
ANEXA Nr. XII:DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VANILINĂ ÎN UNTUL CONCENTRAT, UNT ŞI SMÂNTÂNĂ PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Metoda implică o procedură de determinare cantitativă a vanilinei din untul concentrat, unt şi smântână.
2.Principiu
Extragerea unei cantităţi cunoscute din probă cu ajutorul unui amestec de izopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Precipitarea majorităţii grăsimii prin răcire între -15°C şi -20°C, urmată de centrifugare.
După diluarea cu apă, determinarea conţinutului de vanilină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC).
3.Aparatura
Aparatură obişnuită de laborator şi, în special, următoarele:
3.1.refrigerator cu funcţionare în intervalul de temperatură -15°C şi -20°C;
3.2.seringi de unică folosinţă cu capacitate de 2 ml;
3.3.membrană filtrantă cu pori de 0,45 µm, rezistentă la o soluţie conţinând 5% soluţie de extracţie (4.4);
3.4.sistem de cromatografie lichidă conţinând o pompă (cu debit de 1,0 ml/min), un injector (injectare automată sau manuală a 20 µl), un detector UV (la 306 nm, 0,01 AU scală completă), un înregistrator sau integrator şi o coloană termostat care funcţionează la 25°C;
3.5.coloană analitică (aprox. 20 mm x 3 mm diametru interior) acoperită cu LiChrospher RP 18 (Merk, 5 µm) sau o coloană echivalentă;
3.6.coloană de control (aprox. 20 mm x 3 mm diametru interior) acoperită cu Perisorb RP 18 (30 - 40 µm) sau o coloană echivalentă.
4.Reactivi
Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.
4.1.Izopropanol
4.2.Etanol 96% (v/v)
4.3.Acetonitril
4.4.Soluţie de extracţie
Se amestecă izopropanol (4.1), etanol (4.2) şi acetonitril (4.3) în proporţie de 1:1:2 (v/v).
4.5.Vanilină (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă)
4.5.1.Soluţie "de bază" de vanilină (= 500 µg/ml)
Se cântăresc cu o precizie de 0,1 mg aproximativ 50 mg (CM mg) de vanilină (4.5) într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 25 ml de soluţie de extracţie (4.4) şi se completează cu apă.
4.5.2.Soluţie standard de vanilină (= 10 µg/ml)
Se pipetează 5 ml de soluţie "de bază" de vanilină (4.5.1) într-un balon cotat de 250 ml şi se completează cu apă.
4.6.Metanol, calitate HPLC
4.7.Acid acetic, glacial
4.8.Apă, calitate HPLC
4.9.Faza mobilă HPLC
Se amestecă 300 ml de metanol (4.6) cu aproximativ 500 ml apă (4.8) şi 20 ml de acid acetic (4.7) într-un balon cotat de 1.000 ml şi se completează cu apă (4.8). Se filtrează printr-un filtru de 0,45 µm (3.3).
5.Procedură
5.1.Prepararea probei
5.1.1.Unt
Se încălzeşte proba până când începe să se topească. Se evită supraîncălzirea unor porţiuni din probă la peste 40°C. Când proba devine suficient de fluidă se omogenizează prin scuturare. Se cântăresc cu o precizie de 1 mg aproximativ 5 g de unt într-un balon cotat de 100 ml.
5.1.2.Unt concentrat
Imediat după prelevarea probei, recipientul conţinând unt concentrat se introduce în etuvă la 40 - 50°C până când se topeşte complet. Proba se amestecă prin turbionare sau agitare, evitându-se formarea de bule de aer din cauza amestecării prea puternice. Se cântăresc cu o precizie de 1 mg aproximativ 4 g de unt concentrat într-un balon cotat de 100 ml.
5.1.3.Smântână
Proba se încălzeşte pe baie de apă sau într-un incubator la o temperatură de 35 - 40°C. Grăsimea se distribuie omogen prin turbionare şi, dacă este necesar, prin amestecare. Proba se răceşte rapid la 20 ± 2°C. Proba trebuie să aibă un amestec omogen; în caz contrar procedura trebuie repetată. Se cântăresc cu o precizie de 1 mg aproximativ 10 g de smântână într-un balon cotat de 100 ml.
5.2.Prepararea soluţiei de încercare
Se adaugă aproximativ 75 ml de soluţie de extracţie (4.4) la proba prelevată (5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3), se agită sau se scutură cu putere timp de aproximativ 15 minute şi se completează cu soluţie de extracţie (4.4). Se transferă aproximativ 10 ml din acest extract într-o eprubetă prevăzută cu dop. Eprubeta se introduce în refrigerator (3.1) timp de aproximativ 30 minute. Extractul rece se centrifughează timp de 5 minute la aproximativ 2.000 rpm şi se decantează imediat. Soluţia decantată se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se pipetează 5 ml din soluţia decantată într-un balon cotat de 100 ml şi se completează cu apă. Se filtrează o parte alicotă printr-o membrană microfiltrantă (3.3). Filtratul este gata pentru determinarea HPLC.
5.3.Calibrare
Se pipetează 5 ml de soluţie standard de vanilină (4.5.2) într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 5 ml de soluţie de extracţie (4.4) şi se aduce la semn cu apă. Această soluţie conţine 0,5 µm/ml de vanilină.
5.4.Determinarea HPLC
Se lasă sistemul cromatografic să se stabilizeze timp de aproximativ 30 de minute. Se injectează soluţia standard (5.3). Procedura se repetă până când diferenţa dintre suprafeţele vârfurilor sau dintre înălţimile vârfurilor a două injectări succesive este sub 2%. În condiţiile descrise timpul de retenţie al vanilinei este de aproximativ 9 minute. Soluţia standard (5.3) se analizează în duplicat prin injectarea a 20 µl. Se injectează 20 µl din soluţia de analiză (5.2). Se determină suprafaţa sau înălţimea vârfului obţinut pentru vanilină. Se repetă injectarea soluţiei standard (5.3) în duplicat, modificându-se 10 injectări ale probei (5.2).
6.Calcularea rezultatelor
Se calculează suprafaţa (sau înălţimea) medie a vârfurilor (AC) pentru vârfurile vanilinei asociate injectării duplicatelor la începutul şi la sfârşitul fiecărui lot de soluţie de analiză (în total patru suprafeţe sau înălţimi).
Se calculează coeficientul de răspuns (R):
R = AC/CM
unde CM este masa vanilinei în mg (4.5.1).
Conţinutul (mg/kg) de vanilină (C) din probă se calculează cu ajutorul formulei:
C = (AS x 20 x 0,96)/(SM x R)
unde:
AS = suprafaţa vârfului pentru vârful vanilinei din probă,
SM = masa probei exprimată în g (5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3).
La analiza vanilinei din smântână concentraţia marcatorului se exprimă ca mg marcator/kg grăsime din lapte. Pentru aceasta se înmulţeşte C cu 100/f. f este conţinutul de grăsime al smântânii în procente (m/m).
20 = coeficientul de diluare a probei standard şi a probei,
0,96 = factorul de corecţie pentru conţinutul de grăsime la prima diluare a probei.
Observaţie: În locul suprafeţei vârfului se poate folosi înălţimea vârfului (vezi 8.3).
7.Precizia metodei
7.1.Repetabilitate (r)
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleaşi instrumente şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 16 mg/kg.
7.2.Reproductibilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 27 mg/kg.
8.Limitele de toleranţă
8.1.Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea.
8.2.Marcator obţinut fie din vanilie, fie din vanilină sintetică:
8.2.1.Proporţia de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă este de 250 g pe tonă de unt concentrat sau unt. Pentru smântâna marcată, proporţia de încorporare este de 250 g pe tonă de grăsime din lapte.
8.2.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 221,0 mg/kg (95% din proporţia minimă de încorporare),
- 159,0 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 221,0 mg/kg şi 159,0 mg/kg.
8.3.Marcator obţinut numai din batoane de vanilie sau extracte integrale ale acesteia:
8.3.1.Proporţia de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă este de 100 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smântâna marcată, proporţia de încorporare este de 100 g pe tonă de grăsime din lapte.
8.3.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 79,0 mg/kg (95% din proporţia minimă de încorporare),
- 54,0 mg/kg (70% din proporţia minimă de încorporare).
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 79,0 mg/kg şi 54,0 mg/kg.
9.Observaţii
9.1.Repetabilitatea r este valoarea sub care se consideră că există o probabilitate specifică de producere a unei diferenţe absolute dintre două rezultate de analiză distincte obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în aceleaşi condiţii (aceleaşi instrumente, acelaşi laborator şi într-un interval de timp scurt); în absenţa altor indicaţii, probabilitatea este de 95%.
9.2.Reproductibilitatea R este valoarea sub care se consideră că există o probabilitate specifică de producere a unei diferenţe absolute dintre două rezultate de analize distincte obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în condiţii diferite (operatori diferiţi, instrumente diferite şi/sau momente diferite); în absenţa altor indicaţii, probabilitatea este de 95%.
9.3.Recuperarea vanilinei adăugate la un nivel de 250 mg/kg ulei de unt variază de la 97,0 la 103,8. Conţinutul mediu identificat a fost de 99,9%, cu o deviaţie standard de 2,7%.
9.4.Soluţia standard conţine 5% soluţie de extracţie pentru a compensa creşterea suprafeţei vârfului provocată de prezenţa a 5% soluţie de extracţie în probă. Astfel se poate opera o clasificare în funcţie de înălţimea vârfului.
9.5.Analiza se bazează pe o dreaptă de etalonare, care trece prin punctul zero.
Folosindu-se diluţii adecvate ale soluţiei standard (4.5.2) se verifică liniaritatea în momentul realizării primei analize, iar apoi la intervale regulate şi după modificări sau reparaţii la echipamentul HPLC.
ANEXA Nr. XIII:DETECTAREA PRIN SPECTROMETRIE A ESTERULUI ETILIC AL ACIDULUI BETA-APO-8'-CAROTENIC ÎN UNTUL CONCENTRAT ŞI ÎN UNT
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a esterului etilic al acidului beta-apo-8'-carotenic (ester apo carotenic) în untul concentrat şi în unt. Esterul apo carotenic este suma tuturor substanţelor prezente într-un extract din probe prelevate în condiţiile prevăzute pentru această metodă, care absorb lumină la 440 nm.
2.Principiu
Grăsimea din unt se dizolvă în eter de petrol şi se măsoară absorbanţa la 440 nm. Conţinutul de ester apo carotenic se determină prin raportare la un standard extern.
3.Aparatură
3.1.Pipete - gradate, cu capacitate de 0,25, 0,50, 0,75 şi 1,0 ml.
3.2.Spectrofotometru - adecvat utilizării la 440 nm (şi la 447 - 449 nm) şi prevăzut cu celule de drum optic de 1 cm.
3.3.Baloane cotate, de exemplu de 20 ml şi de 100 ml.
3.4.Balanţă analitică cu sensibilitate de 0,1 mg.
4.Reactivi
Toţi reactivii trebuie să aibă o puritate analitică cunoscută.
4.1.Suspensie de acid apo carotenic (aproximativ 20%).
4.1.1.Conţinutul suspensiei se determină astfel:
Se cântăresc aproximativ 400 mg într-un balon cotat (100 ml), se dizolvă în cloroform (4.4) şi se completează volumul cu ciclohexan (4.5). Se diluează 5,0 ml din această soluţie cu 100 ml de ciclohexan (soluţia A). Se diluează 5,0 ml de soluţie A cu ciclohexan până la 100 ml.
Se măsoară absorbanţa la 447 - 449 nm (se măsoară valoarea maximă faţă de o probă de ciclohexan ca probă martor, folosindu-se celule cu drum optic de 1 cm).
Conţinutul de ester apo carotenic (%) = A(max) x 40.000/A x 2.550
unde:
A(max) = absorbanţa soluţiei de măsurare la maximum,
A = greutatea probei (g),
2.550 = valoarea de referinţă A (1%, 1 cm).
Puritatea suspensiei este P (%).
Observaţii: Suspensia de ester apo carotenic este sensibilă la aer, căldură şi lumină. Se poate păstra la loc rece timp de aproximativ 12 luni, în recipientul original închis (sigilat sau azot). După deschiderea recipientului, conţinutul trebuie utilizat cât mai repede posibil.
4.1.2.Soluţia standard de ester apo carotenic, aproximativ 0,2 mg/ml. cantitativ într-un balon cotat cu capacitate de 100 ml şi se aduce la semn cu ligroină.
Această soluţie conţine (W*P)/100 mg/ml de ester apo carotenic.
Observaţie: Soluţia trebuie păstrată la rece şi la întuneric. Soluţia nefolosită se aruncă după o lună.
4.2.Ligroină (40-60°C).
4.3.Sulfat de sodiu anhidru, granulat, uscat în prealabil la 102°C timp de 2 ore.
4.4.Cloroform.
4.5.Ciclohexan.
5.Procedură
5.1.Prepararea probei de analiză
5.1.1.Unt concentrat
Proba se topeşte în etuvă la aproximativ 45°C.
5.1.2.Unt
Proba se topeşte în etuvă la aproximativ 45°C şi se filtrează o parte reprezentativă printr-un filtru care conţine aproximativ 10 g de sulfat de sodiu anhidru (4.3) într-un mediu protejat de lumina naturală sau artificială puternică şi se păstrează la 45°C. Se colectează o cantitate adecvată de grăsime din unt.
5.2.Determinare
Se cântăreşte, cu precizia de 1 mg, aproximativ 1 g de unt concentrat, (sau grăsime extrasă din unt (5.1.2)), (mg). Se transferă cantitativ într-un balon cotat de 20 ml (Vml), folosindu-se ligroină (4.2), se aduce la semn şi se amestecă bine.
Se transferă o parte din alicotă într-o celulă cu drum optic de 1 cm şi se măsoară absorbanţa la 440 nm, faţă de o probă martor dt ligroină. Concentraţia de ester apo carotenic în soluţie se determină conform curbei de etalonare (C µg/ml).
5.3.Curba de etalonare
Se pipetează 0, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0 ml de soluţie standard de ester apo carotenic (4.1.2) în cinci baloane cotate de 100 ml. Se diluează la volum cu ligroină (4.2) şi se amestecă.
Concentraţiile aproximative ale soluţiei variază între 0 şi 2 µg/ml. Se măsoară absorbanţa la 440 nm faţă de o probă martor de ligroină (4.2).
Valorile absorbanţei se reprezintă pe axa y, iar pe axa x se reprezintă concentraţia esterului apo carotenic.
6.Calcularea rezultatelor
6.1.Conţinutul de ester apo carotenic, exprimat în mg/produs, se calculează după cum urmează:
Unt concentrat: (C.V)/m
Unt: 0,82 (C.V)/m
unde:
C = conţinutul de ester apo carotenic, în µg/ml, citit de pe curba de etalonare (5.3),
V = volumul (ml) soluţiei de analiză (5.2),
m = masa (g) cantităţii analizate (5.2),
0,82 = factorul de corecţie pentru conţinutul de grăsime al untului.
7.Precizia metodei
7.1.Repetabilitate
7.1.1.Analiza untului
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleaşi instrumente şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 1,4 mg/kg.
7.1.2.Analiza untului concentrat
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleaşi instrumente şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 1,6 mg/kg.
7.2.Reproductibilitate
7.2.1.Analiza untului
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 4,7 mg/kg.
7.2.2.Analiza untului concentrat
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 5,3 mg/kg.
7.3.Sursa datelor de precizie
Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1995 în Uniunea Europeană, în cadrul căruia au participat 11 laboratoare şi s-au folosit 12 probe urmărite (şase duplicate probă martor) pentru unt şi 12 probe urmărite (şase duplicate probă martor) pentru unt concentrat.
8.Limitele de toleranţă
8.1.Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea.
8.2.Unt
8.2.1.Rata de încorporare pentru unt, având în vedere absorbanţa de fond este de 22 mg/kg.
8.2.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 18,0 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare),
- 13,0 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).
Concentraţia marcatorilor din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 18,0 mg/kg şi 13,0 mg/kg.
8.3.Unt concentrat
8.3.1.Rata de încorporare pentru untul concentrat, având în vedere absorbanţa de fond, este de 24 mg/kg.
8.3.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 20,0 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare),
- 14,0 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).
Concentraţia marcatorilor din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 20,0 mg/kg şi 14,0 mg/kg.
ANEXA Nr. XIV:DETERMINAREA SITOSTEROLULUI SAU STIGMASTEROLULUI DIN UNT ŞI UNT CONCENTRAT PRIN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ DE GAZ CU COLOANĂ CAPILARĂ
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Metoda descrie o procedură care permite determinarea cantitativă a sitosterolului sau a stigmasterolului de unt şi unt concentrat. Conţinutul de sitosterol reprezintă suma cantităţilor de beta-sitosterol şi de 22-dihidro-beta-sitosterol, ceilalţi fiind consideraţi nesemnificativi.
2.Principiu
Untul sau untul concentrat este saponificat cu hidroxid de potasiu într-o soluţie de etanol, iar substanţele nesaponificabile sunt extrase cu ajutorul dietil eterului.
Sterolii se transformă în trimetil-silil-eteri şi sunt analizaţi prin cromatografie în fază de gaz cu coloană capilară prin raportare la un etalon intern/betulină.
3.Aparatură
3.1.Balon de saponificare de 150 ml, dotat cu un refrigerent cu reflex cu capete rodate.
3.2.Pâlnii de separare de 500 ml.
3.3.Baloane de 250 ml.
3.4.Conducte de egalizare a presiunii, de 250 ml sau cu o capacitate similară, pentru a colecta dietil eterul rezidual.
3.5.Coloană de sticlă de 350 mm x 20 mm, prevăzută cu un racord cu frită.
3.6.Baie de apă sau termostat.
3.7.Eprubete de reacţie de 2 ml.
3.8.Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de scindare format din următoarele:
3.8.1.Incinta de termostatare pentru coloane, care poate menţine temperatura dorită cu o precizie de ± 1°C;
3.8.2.Injector termoreglabil;
3.8.3.Detector cu ionizare în flacără şi convertor-amplificator;
3.8.4.Integrator-înregistrator care poate fi utilizat cu convertorul - amplificator (3.8.3);
3.9.Coloană capilară din sticlă de siliciu acoperită în întregime de BP 1 sau de o substanţă echivalentă în strat uniform cu grosimea de 0,25 µm; coloana trebuie să poată reduce derivaţii trimetil-silil ai lanosterolului şi ai sitosterolului. Este recomandabil să se utilizeze o coloană BP 1 cu lungimea de 12 cm şi diametrul intern de 0,2 mm.
3.10.Microseringă cu ac din oţel inoxidabil de 1 µl pentru cromatografie cu gaz.
4.Reactivi
Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă.
4.1.Etanol, cu o puritate de cel puţin 95%.
4.2.Hidroxid de potasiu, soluţie 60%, prin dizolvarea a 600 g de hidroxid de potasiu (minimum 85%) în apă, la care se adaugă apă până la 1 l.
4.3.Betulină cu o puritate de cel puţin 99%.
4.3.1.Soluţii de betulină în eter etilic (4.4).
4.3.1.1.Concentraţia soluţiei de betulină utilizată pentru determinarea sitosterolului trebuie să fie de 1,0 mg/ml.
4.3.1.2.Concentraţia soluţiei de betulină utilizată pentru determinarea stigmasterolului trebuie să fie de 0,4 mg/ml.
4.4.Eter etilic de puritate analitică (fără peroxizi sau reziduuri).
4.5.Sulfat de sodiu anhidru granulat, uscat în prealabil la 102°C timp de 2 ore.
4.6.Reactiv de sililare, de exemplu, TRI-SIL (poate fi procurat de la Pierce Chemical Co., Categoria nr. 49.001) sau un reactiv echivalent. (Atenţie: TRI-SIL este inflamabil şi are un posibil potenţial cancerigen. Personalul de laborator trebuie să cunoască normele de siguranţă aplicabile în cazul utilizării TRI-SIL şi trebuie să ia toate măsurile de precauţie care se impun).
4.7.Lanosterol
4.8.Sitosterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90% (P).
Observaţia 1: Puritatea materialelor etalon utilizate pentru calibrare trebuie determinată prin metoda de normalizare. Se presupune că toţi sterolii din probă sunt reprezentaţi în cromatogramă, că suprafaţa totală a vârfurilor reprezintă 100% din compuşii sterolilor şi că sterolii dau aceeaşi reacţie la detector. Liniaritatea sistemului trebuie validată pentru nivelurile de concentraţie luate în calcul.
4.8.1.Soluţie de etalon de sitosterol: se prepară o soluţie cu precizie de 0,001 mg/ml, conţinând aproximativ 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) în eter etilic (4.4).
4.9.Stigmasterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90% (P).
4.9.1.Soluţie de etalon de stigmasterol: se prepară o soluţie cu precizie de 0,001 mg/ml, conţinând aproximativ 0,2 mg/ml (W1) de stigmasterol (4.9) în eter etilic (4.4).
4.10.Amestec pentru testul de rezoluţie. Se prepară o soluţie conţinând 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) şi 0,5 mg/ml de sitosterol (4.8) în eter etilic.
5.Procedura
5.1.Prepararea soluţiilor etalon pentru cromatografie. Se adaugă soluţia etalon intern (4.3.1) la soluţia etalon de sterol adecvată şi, simultan, la proba saponificată (vezi 5.2.2).
5.1.1.Soluţia cromatografică etalon de sitosterol: se transferă 1 ml de soluţie etalon de sitosterol (4.8.1) în fiecare din cele două eprubete de reacţie (3.7) şi se elimină etil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluţie de etalon intern (4.3.1.1) şi se elimină etil eterul sub flux de azot.
5.1.2.Soluţia cromatografică etalon de stigmatosterol: se transferă 1 ml de soluţie etalon de stigmatosterol (4.9.1) în fiecare din cele două eprubete de reacţie (3.7) şi se elimină etil eterul în curent de azot. Se adaugă 1 ml de soluţie de etalon intern (4.3.1.2) şi se elimină etil eterul în curent de azot.
5.2.Prepararea substanţelor nesaponificabile
5.2.1.Se topeşte proba de unt la o temperatură de maximum 35°C; se amestecă cu grijă.
Se cântăreşte, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt (W2) sau de unt concentrat (W2) într-un balon de 150 ml (3.1). Se adaugă 50 ml de etanol (4.1) şi 10 ml de soluţie de hidroxid de potasiu (4.2). Se adaptează refrigerentul cu reflux şi se aduce la aproximativ 75°C timp de 30 de minute. Se deconectează refrigerentul şi se lasă balonul să se răcească la temperatura camerei.
5.2.2.Se adaugă în balon 1,0 ml de soluţie etalon intern (4.3.1.1) dacă se determină sitosterolul sau (4.3.1.2) dacă se determină stigmasterolul. Se amestecă bine. Se transferă cantitativ conţinutul balonului într-o pâlnie de separare de 500 ml (3.2), se spală balonul cu 50 ml de apă, apoi cu 250 ml de eter etilic (4.4). Se agită puternic conducta de decantare timp de 2 minute şi se lasă fazele să se separe. Se elimină faza apoasă inferioară şi se spală faza eterică agitându-se succesiv de 4 ori, cu câte 100 ml apă.
Observaţia 2: Pentru a evita formarea unei emulsii, este neapărat necesar ca primele două spălări cu apă să se efectueze uşor (10 răsturnări). Pentru a treia spălare, se poate agita mai puternic timp de 30 de secunde. Dacă se formează o emulsie, aceasta poate fi eliminată prin adăugarea a 5 până la 10 ml de etanol. Dacă se adaugă etanol, este absolut necesar să se efectueze încă două spălări puternice cu apă.
5.2.3.Se trece faza eterică limpede şi desaponificată printr-o coloană de sticlă (3.5) care conţine 30 g de sulfat de sodiu anhidru (4.5). Se colectează eterul într-un balon de 250 ml (3.3). Se adaugă bile de sticlă şi se evaporă până la uscare aproape completă pe o baie de apă sau într-un termostat colectându-se solvenţii care trebuie eliminaţi.
Observaţia 3: Dacă anumite probe se evaporă complet la o temperatură prea ridicată este posibil să se piardă cantităţi de sterol.
5.3.Prepararea trimetil-silil-eterilor.
5.3.1.Se transferă soluţia de eter rămasă în balon într-o eprubetă de reacţie de 2 ml (3.7) cu ajutorul a 2 ml de dietil eter şi se elimină eterul în curent de azot. Se spală balonul de două ori cu câte 2 ml de eter etilic, transferându-se conţinutul în eprubetă şi eliminându-se eterul de fiecare dată în curent de azot.
5.3.2.Se sililează proba prin adăugarea a 1 ml de TRI-SIL (4.6). Se astupă eprubeta şi se agită puternic pentru a produce dizolvarea. Dacă proba nu s-a dizolvat complet, se aduce la temperatura de 65-70°C. Se lasă să stea cel puţin 5 minute înainte de a se injecta în cromatograful cu gaz. Se sililează etaloanele în acelaşi mod ca şi probele. Se sililează amestecul pentru testul de rezoluţie (4.10) în acelaşi mod ca şi probele.
Observaţia 4: Sililarea trebuie efectuată într-un mediu anhidru. Sililarea incompletă a betulinei se recunoaşte prin obţinerea unui al doilea vârf apropiat de cel al betulinei.
Prezenţa etanolului în timpul sililării va interfera cu procesul de sililare. Acest fapt poate fi consecinţa unei spălări insuficiente în momentul extragerii. Dacă această problemă persistă, în etapa de extragere se va include o a cincea spălare, cu agitare puternică timp de 30 de secunde.
5.4.Analiza prin cromatografie cu gaz
5.4.1.Alegerea condiţiilor pentru procedură
Se programează cromatograful cu gaz conform instrucţiunilor producătorului.
Condiţiile indicate pentru procedură sunt următoarele:
- temperatura coloanei: 265°C
- temperatura injectorului: 265°C
- temperatura detectorului: 300°C
- debitul gazului purtător: 0,6 ml/min.
- presiunea hidrogenului: 84 kPa
- presiunea aerului: 155 kPa
- fracţionarea probei: de la 10/1 la 50/1; raportul de fracţionare trebuie optimizat în funcţie de instrucţiunile producătorului şi de liniaritatea răspunsului detectorului, şi validat ulterior în funcţie de intervalele de concentraţii luate în considerare.
Observaţia 5: Curăţarea regulată a camerei de vaporizare este deosebit de importantă.
- cantitatea de substanţă injectată: 1 µl de soluţie TSME.
Se lasă sistemul să se echilibreze până când se obţine un răspuns suficient de stabil înainte de a se efectua vreo analiză.
Aceste condiţii pot fi modificate în funcţie de caracteristicile coloanei şi ale cromatografului cu gaz, pentru a se obţine cromatograme care să îndeplinească condiţiile următoare:
- vârful sitosterolului trebuie să prezinte o rezoluţie suficientă faţă de lanosterol. Figura 1 prezintă o cromatogramă tipică, cea care trebuie obţinută pentru un amestec sililat prin testul de rezoluţie (4.10).
- timpii relativi de retenţie ai sterolilor de mai jos trebuie să fie de aproximativ:
colesterol 1,0
stigmasterol 1,3
sitosterol 1,5
betulină 2,5
- timpul de retenţie al betulinei trebuie să fie de aproximativ 24 minute.
5.4.2.Modul de lucru
Se injectează 1 µl de soluţie etalon sililată (stigmasterol sau sitosterol) şi se ajustează parametrii de calibrare ai integratorului.
Se injectează din nou 1 µl de soluţie etalon sililată pentru a se determina coeficientul de răspuns faţă de betulină.
Se injectează 1 µl de soluţie de probă sililată şi se măsoară suprafaţa vârfurilor. Fiecare serie de probe trebuie precedată şi urmată de o injectare de soluţie etalon.
De regulă, injectarea soluţiei de probă se poate efectua după o serie de şase probe.
Observaţia 6: Integrarea vârfului stigmasterolului trebuie să prezinte curbele indicate la punctele 1, 2 şi 3 din figura 2b.
Integrarea vârfului sitosterolului trebuie să înglobeze suprafaţa vârfului 22-dihidro-beta-sitosterolului (stigmastanol) care apare imediat după sitosterol (vezi figura 3b) în momentul evaluării şi sitosterolului total.
6.Calcularea rezultatelor
6.1.Se determină suprafaţa vârfurilor sterolului şi a vârfurilor betulinei în cele două etaloane, la începutul şi la finalul fiecărei serii, şi se calculează R1:
R1 = suprafaţa medie a vârfului sterolului în etalon/suprafaţa medie a vârfului betulinei în etalon
Se determină suprafaţa vârfului de sterol (stigmasterol sau sitosterol) şi a vârfului betulinei în probă şi se calculează R2:
R2 = suprafaţa vârfului sterolului în probă/suprafaţa vârfului betulinei în probă
W1 = conţinutul de sterol al etalonului (mg) din 1 ml de soluţie etalon (4.8.1 sau 4.9.1),
W2 = masa probei (g) (5.2.1),
P = puritatea sterolului etalon (4.8 sau 4.9).
Conţinutul de sterol din probă (mg/kg) = R2/R1 x W1/W2 x P x 10
7.Precizia metodei
7.1.Unt
7.1.1.Repetabilitate
7.1.1.1.Stigmasterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceeaşi aparatură de analiză identic nu trebuie să depăşească 19,3 mg/kg.
7.1.1.2.Sitosterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceeaşi aparatură de analiză identic nu trebuie să depăşească 23,0 mg/kg.
7.1.2.Reproductibilitate
7.1.2.1.Stigmasterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 31,9 mg/kg.
7.1.2.2.Sitosterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 8,7 mg/kg.
7.1.3.Sursa datelor de precizie
Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1992 (ţările comunitare) în care au fost implicate opt laboratoare şi şase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol şi şase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.
7.2.Unt concentrat
7.2.1.Repetabilitate
7.2.1.1.Stigmasterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceeaşi aparatură de analiză identic nu trebuie să depăşească 10,2 mg/kg.
7.2.1.2.Sitosterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceeaşi aparatură de analiză identic nu trebuie să depăşească 3,6 mg/kg din valoarea medie a acestor determinări.
7.2.2.Reproductibilitate
7.2.2.1.Stigmasterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 25,3 mg/kg.
7.2.2.2.Sitosterol
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 8,9 mg/kg din valoarea medie a acestor determinări.
7.2.3.Sursa datelor de precizie
Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1991 în care au fost implicate opt laboratoare şi şase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol şi şase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.
8.1.Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.
8.2.Unt
8.2.1.Stigmasterol
8.2.1.1.Proporţia de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol cu o puritate de cel puţin 95%, pe o tonă de unt, adică 142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 85%, pe o tonă de unt, adică 144,5 mg/kg.
8.2.1.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 116,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%),
- 118,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 85% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%),
- 81,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%),
- 82,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%),
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 116,0 mg/kg şi 81,0 mg/kg sau între 118,0 mg/kg şi 82,0 mg/kg.
8.2.2.Sitosterol
8.2.2.1.Proporţia de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puţin 90%, pe o tonă de unt, adică 540 mg/kg.
8.2.2.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 486,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 95% pentru sitosterol cu o puritate de 90%),
- 358,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru sitosterol cu o puritate de 90%),
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 486,0 mg/kg şi 358,0 mg/kg.
8.3.Unt concentrat
8.3.1.Stigmasterol
8.3.1.1.Proporţia de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol cu o puritate de cel puţin 95%, pe o tonă de unt concentrat, adică 142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 85%, pe o tonă de unt concentrat, adică 144,5 mg/kg.
8.3.1.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 120,0 mg/kg (proporţia rată de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%),
- 122,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%),
- 84,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%),
- 86,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%),
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 120,0 mg/kg şi 84,0 mg/kg sau între 122,0 mg/kg şi 86,0 mg/kg.
8.3.2.Sitosterol
8.3.2.1.Proporţia de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puţin 90%, pe o tonă de unt concentrat, adică 540 mg/kg.
8.3.2.2.Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea proporţiei şi omogenităţii de încorporare a marcatorului, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite (avându-se în vedere o diferenţă critică pentru un nivel de probabilitate de 95% (DCr95)):
- 486,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 95% pentru sitosterol cu o puritate de 90%),
- 358,0 mg/kg (proporţia de încorporare minimă de 70% pentru sitosterol cu o puritate de 90%),
Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cei mai slab este utilizată prin interpolare între 486,0 mg/kg şi 358,0 mg/kg.
Figura 1
Cromatograma amestecului pentru testul de rezoluţie
Este de preferat rezoluţia completă, adică traseul vârfului lanosterolului trebuie să atingă linia de bază înainte de ieşirea din vârf a sitosterolului, cu toate că şi o rezoluţie incompletă este acceptabilă.
Probă de unt denaturat cu stigmasterol
Ordonată: Răspunsul detectorului cu ionizare cu flacără
Colesterol
Lanosterol
Stigmatosterol
Betulină (etalon intern)
Abscisă: Timpul (în minute)
Observaţie: Integrarea vârfului stigmasterolului trebuie să includă toate traseele cuprinse între punctele 1, 2 şi 3.
Figura 3a
ANEXA Nr. XV:METODĂ DE REFERINŢĂ PENTRU DETECTAREA BACTERIILOR COLIFORME DIN UNT, LAPTE PRAF DEGRESAT, CAZEINĂ ŞI CAZEINAŢI
La analiza untului pentru detectarea prezenţei bacteriilor coliforme se inoculează probe de 1 g de unt în mediul de cultură.
Pentru detectarea prezenţei bacteriilor coliforme în lapte praf degresat sau cazeină/cazeinaţi, se inoculează probe de 0,1 g în mediul de cultură.
Se foloseşte standardul FIL 73A:1985, metoda B cu următoarele modificări:
1) Pregătirea probelor se face conform standardului FIL 122B:1992. Pentru cazeină acidă se poate folosi ca alternativă procedura de preparare a probelor descrisă în standardul FIL 73A:1985.
2) Se incubează şi se evaluează numai eprubete în care s-au inoculat probe de 1 g (de unt) sau de 0,1 g (de lapte praf degresat sau respectiv de cazeină/cazeinaţi). Nu se fac diluări zecimale.
Evaluarea rezultatelor
Trei rezultate negative: | Cerinţa este îndeplinită |
Două sau trei rezultate pozitive: | Cerinţa nu este îndeplinită |
Două rezultate negative: | Se analizează încă două probe cu masa de 1 g (unt) şi 0,1 g (de lapte praf degresat, cazeina/cazeinaţi) |
Dacă ultimele două rezultate sunt negative, cerinţa este îndeplinită; în caz contrar cerinţa nu este îndeplinită. |
Observaţie
Conţinut de bacterii coliforme: 1/10 g pentru unt; 1/g în medie pentru lapte praf degresat, cazeină/cazeinaţi.
Rezultatele care indică satisfacerea cerinţei trebuie să aibă o probabilitate de 93%.
Conţinutul de bacterii coliforme: 1/g pentru unt; 1/0,1 g în medie pentru lapte praf degresat sau cazeină/cazeinaţi.
Rezultatele care indică faptul că cerinţa nu a fost satisfăcută trebuie să aibă o probabilitate de 91%.
(Ipoteză: distribuţia Poisson)
ANEXA Nr. XVI:METODĂ DE DETERMINARE A CONŢINUTULUI DE LACTOZĂ AL PRODUSELOR CU COD NUMERIC 2309
PARTEA I
1.Domeniu de aplicare
Metoda se aplică în cazurile în care conţinutul de lactoză depăşeşte 0,5%.
2.Principiu
Se dizolvă zaharurile în apă. Se lasă drojdia (Saccharomyces cerevisiae) să acţioneze; lactoza va rămâne intactă. Se determină conţinutul de lactoză al soluţiei prin metoda Luff-Schoorl după decantare şi filtrare.
3.Reactivi
Tiosulfat de sodiu 0,1 N.
Indicator: soluţie de amidon. Se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil (ca agent de conservare se pot adăuga 10 mg de iodură de mercur) şi 30 ml de apă la un litru de apă care fierbe; amestecul se lasă să fiarbă timp de trei minute; se lasă să se răcească.
Soluţie AR de iodură de potasiu la 30% (m/v).
Soluţie de acid sulfuric 6 N.
Reactiv Luff-Schoorl:
a)Se dizolvă 25 g de sulfat de cupru II pentahidrat fără fier (CuSO45H2O) în 100 ml de apă
b)Se dizolvă 50 g de acid citric monohidrat (C6H8O7H2O) în 50 ml de apă
c)Se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru (Na2CO3) în aproximativ 300 ml de apă fierbinte şi se lasă să se răcească.
Se adaugă (b) la (c) şi se agită uşor, apoi se adaugă (a). Se completează până la 1 litru, se lasă să stea peste noapte şi apoi se filtrează. Se verifică normalitatea reactivului obţinut în acest mod (Cu 0,1 N, Na2CO32N). pH-ul trebuie să fie de aproximativ 9,4.
Soluţie Carrez: se dizolvă 23,8 g Zn(C2H3O2)22H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă şi se completează până la 100 ml.
Carrez II: se dizolvă 10,6 g de K4F2(CN)63H2O în apă şi se completează până la 100 ml.
Granule de piatră ponce, tratate cu acid clorhidric fierbinte, clătite cu apă şi uscate. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: 25 g de drojdie proaspătă în 100 ml de apă (a nu se păstra în frigider mai mult de o săptămână).
4.Procedură
Se cântăreşte cu precizie de 1 mg 1 g din proba de analiză; aceasta se introduce într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 25-30 ml de apă. Balonul se introduce într-o baie de apă la fierbere timp de 30 de minute, apoi se răceşte la aproximativ 35°C.
Se adaugă 5 ml de suspensie de drojdie1) şi se agită. Balonul cotat şi conţinutul acestuia se lasă timp de două ore într-o baie de apă la temperatura de 38 - 40°C.
1)Pentru produsele care conţin peste 40% zahăr fermentabil, se adaugă o cantitate mai mare de suspensie.
După terminare se răceşte la aproximativ 20°C. Se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez I şi se agită timp de 30 de secunde; apoi se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez II şi se agită din nou treizeci de secunde. Se completează cu apă până la 100 ml, se amestecă şi se filtrează. Se pipetează o cantitate de filtrat nu mai mare de 25 ml, care să conţină de preferinţă 40 - 80 mg de lactoză; se completează până la 25 ml cu apă şi se determină conţinutul de lactoză anhidră prin metoda Luff-Schoorl.
Se realizează un test complet cu probă martor numai pentru drojdie.
PARTEA II
Determinarea conţinutului de lactoză prin metoda Luff-Schoorl
Se pipetează 25 ml de reactiv Luff-Schoorl şi se introduce într-un balon Erlenmeyer de 300 ml; se adaugă 25 ml măsuraţi cu precizie din soluţia decantată.
Se adaugă două granule de piatră ponce, apoi se încălzeşte, se agită manual pe o flacără deschisă de înălţime medie şi se aduce lichidul la punctul de fierbere timp de aproximativ două minute. Balonul Erlenmeyer se aşează mediat pe o sită metalică cu azbest sub care se aprinde în prealabil o flacără. Aceasta se reglează astfel încât să fie încălzit numai fundul paharului Erlenmeyer; apoi se instalează un condensator cu reflux. Din acest moment se fierbe timp de exact zece minute. Se răceşte mediat în apă rece şi după aproximativ cinci minute se analizează după cum urmează:
Se adaugă lichidului 10 ml de iodură de potasiu şi imediat, dar cu grijă (întrucât se poate produce o spumare abundentă) 25 ml de acid sulfuric 6 N.
Se efectuează aceeaşi analiza folosindu-se un amestec format din exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl şi 25 ml de apă după adăugarea a 10 ml de iodură de potasiu şi 25 ml de acid sulfuric 6 N fără a se aduce la punctul de fierbere.
Pe baza următorului tabel se stabileşte cantitatea de lactoză exprimată în mg care corespunde diferenţei între rezultatele a două analize (exprimate în ml de soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N).
TABEL
Tabel pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl
(vezi condiţiile din textul de mai sus)
1.Tiosulfat de sodiu 0,1 N
2.Lactoză C12H22O11
1 | 2 | 1 | 2 | ||
ml | mg | Diferenţă | ml | mg | Diferenţă |
1 | 3,6 | 12 | 44,6 | ||
3,7 | 3,8 | ||||
2 | 7,3 | 13 | 48,4 | ||
3,7 | 3,8 | ||||
3 | 11,0 | 14 | 52,2 | ||
3,7 | 3,8 | ||||
4 | 14,7 | 15 | 56,0 | ||
3,7 | 3,9 | ||||
5 | 18,4 | 16 | 59,9 | ||
3,7 | 3,9 | ||||
6 | 22,1 | 17 | 63,8 | ||
3,7 | 3,9 | ||||
7 | 25,8 | 18 | 67,7 | ||
3,7 | 4,0 | ||||
8 | 29,5 | 19 | 71,7 | ||
3,7 | 4,0 | ||||
9 | 33,2 | 20 | 75,7 | ||
3,8 | 4,1 | ||||
10 | 37,0 | 21 | 79,8 | ||
3,8 | 4,1 | ||||
11 | 44,8 | 22 | 83,9 | ||
3,8 | 4,1 | ||||
23 | 88,0 | ||||
ANEXA Nr. XVII:DETECTAREA ZERULUI PRAF DIN LAPTELE PRAF DEGRESAT DESTINAT DEPOZITĂRII PUBLICE PRIN DETERMINAREA GLICOMACROPEPTIDELOR PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Această metodă permite detectarea zerului obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui la fabricarea brânzeturilor, din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea glicomacropeptidelor.
2.Referinţe
Standardul internaţional ISO 707 - Lapte şi produse lactate - Metode de prelevare a probelor conform indicaţiilor din anexa I (2) lit. (c) ultimul paragraf.
3.Definiţie
Conţinutul de glicomacropeptide al laptelui praf degresat: conţinutul de substanţe determinat prin metoda de mai jos, exprimat ca procent de masă.
4.Principiu
- Reconstituirea laptelui praf degresat, îndepărtarea grăsimilor şi proteinelor cu acid tricloracetic, urmată de centrifugare;
- Determinarea cantităţii de glicomacropeptide (GMP) din supranatant prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC);
- Evaluarea rezultatelor obţinute pentru probe faţă de probe etalon formate din lapte praf degresat cu sau fără adăugarea unui procent cunoscut de zer praf.
5.Reactivi
Toţi reactivii trebuie să aibă o puritate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă.
5.1.Soluţie de acid tricloracetic
Se dizolvă 240 g de acid tricloracetic (Cl3CCOOH) în apă şi se completează până la 1.000 ml.
5.2.Soluţie eluantă, pH 6,0
Se dizolvă 1,74 g de fosfat dipotasic (K2HPO4), 12,37 g de fosfat monopotasic (KH2PO4) şi 21,41 g de sulfat de sodiu (Na2SO4) în aproximativ 700 ml de apă. Dacă este necesar se ajustează cu ajutorul unei soluţii de acid fosforic sau hidroxid de potasiu până la obţinerea unui pH de 6,0.
Se completează cu apă până la 1.000 ml şi se omogenizează.
Soluţia eluantă se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 µm.
5.3.Solvent de spălare
Se amestecă un volum de acetonitril (CH3CN) cu nouă volume de apă. Amestecul se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu pori de diametrul de 0,45 µm.
Observaţii: Se poate folosi orice alt solvent de spălare cu efect bactericid care nu afectează eficienţa rezoluţiei coloanelor.
5.4.Probe etalon
5.4.1.Lapte praf degresat care îndeplineşte cerinţele acestei Rezoluţii (adică [0]).
5.4.2.Acelaşi lapte praf degresat modificat cu 5% (m/m) zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor, praf cu compoziţie standard (adică [5]).
6.Aparatură
6.1.Balanţă analitică.
6.2.Centrifugă capabilă să realizeze o acceleraţie de 2.200 g, prevăzută cu tuburi cu capac pentru centrifugare, cu o capacitate de aproximativ 25 ml.
6.3.Agitator mecanic.
6.4.Agitator magnetic.
6.5.Coloane de sticlă cu diametrul de aproximativ 7 cm.
6.6.Filtre de hârtie care asigură o viteză medie de filtrare cu diametrul de aproximativ 12,5 cm.
6.7.Dispozitiv de sticlă pentru filtrare prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 µm.
6.8.Pipete gradate de 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835).
6.9.Baie termostat de apă, reglată la 25 ± 0,5°C.
6.10.Echipament pentru HPLC format din:
6.10.1. Pompă
6.10.2. Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 15 - 30 ml.
6.10.3. Două coloane TSK 2.000-SW în serie (lungime de 30 cm, diametru intern de 0,75 cm) sau coloane echivalente şi o precoloană (3 cm x 0,3 cm) acoperite cu material I 125 sau cu un material cu eficienţă echivalentă.
6.10.4. Termostat pentru coloană, reglat la 35 ± 1°C.
6.10.5. Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite realizarea de măsurători la 205 nm cu o sensibilitate de 0,008 A.
6.10.6. Integrator cu ajutorul căruia se poate realiza integrarea la linia de bază.
Observaţie: Se poate lucra cu coloanele aflate la temperatura camerei, dar puterea lor de rezoluţie este puţin mai mică. În acest caz, temperatura nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 5°C în nici o serie de analize.
7.Prelevarea probelor
7.1.Standardul internaţional ISO 707 - "Lapte şi produse lactate - Metode de prelevare a probelor" conform indicaţiilor din anexa I (2) lit. (c) ultimul paragraf.
7.2.Probele etalon se depozitează în condiţii în care nu poate surveni nici o deteriorare sau modificare a compoziţiei.
8.Proceduri
8.1.Prepararea probei de analiză
Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă faţă de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanş la aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.
8.2.Cantitatea analizată
Se cântăresc 2,000 + 0,001 g din proba analizată într-un tub de centrifugare (6.2).
8.3.Îndepărtarea grăsimii şi a proteinelor
8.3.1.Se adaugă 20 g de apă caldă (50°C) la cantitatea analizată. Se dizolvă laptele praf agitându-se câteva minute cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se răceşte la 25°C.
8.3.2.Se adaugă 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (5.1) timp de două minute, amestecându-se continuu cu ajutorul unui agitator magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.9) şi se lasă timp de 60 de minute.
8.3.3.Se centrifughează (6.2) timp de 10 minute la 2.200 g sau se filtrează printr-o hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat.
8.4.Determinarea cromatografică
8.4.1.Se injectează 15-20 µl de supernatant sau filtrat (8.3.3) măsurat cu precizie în aparatul HPLC (6.10) funcţionând la un debit de 1,0 ml de soluţie eluantă (5.2) pe minut.
Observaţii:
1.Soluţia eluantă (5.2) se menţine la 85°C pe parcursul întregii analize cromatografice pentru ca eluantul să se menţină degazat şi pentru a împiedica dezvoltarea bacteriilor. Se poate recurge la orice măsură de precauţie cu efect similar.
2.Coloanele se clătesc cu apă la fiecare întrerupere. Soluţia nu se lasă niciodată în coloane (5.2).
Înainte de orice întrerupere care durează mai mult de 24 de ore, coloanele se clătesc cu apă şi se spală cu soluţie (5.3) timp de cel puţin trei ore la un debit de 0,2 ml pe minut.
8.4.2.Rezultatele analizei cromatografice a probei etalon [E] se obţin sub forma unei cromatograme în care fiecare vârf se identifică după timpul de retenţie RT după cum urmează:
Vârful II: Al doilea vârf al cromatogramei cu un RT de aproximativ 17,5 minute.
Vârful III: Al treilea vârf al cromatogramei, corespunzând GMP, cu un RT de 15,5 ± 1,0 minute.
Vârful IV: Al patrulea vârf al cromatogramei cu un RT de aproximativ 17,5 minute.
Calitatea coloanei poate afecta timpii de retenţie al fiecărui vârf.
Integratorul (6.10.6) calculează automat suprafaţa A a fiecărui vârf.
A(II): suprafaţa vârfului II.
A(III): suprafaţa vârfului III.
A(IV): suprafaţa vârfului IV.
Este esenţial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de realizarea interpretării cantitative pentru a se detecta orice eventuale anomalii datorate fie funcţionării necorespunzătoare a aparatului sau a coloanelor, fie originii sau naturii probei analizate.
8.5.Calibrarea
8.5.1.Probelor standard (5.4) li se aplică exact procedura descrisă de la pct. 8.2 la pct. 8.4.2. Se folosesc soluţii proaspăt preparate, întrucât GMP se degradează într-un mediu 8% tricloracetic. Pierderea este estimată la 0,2% pe oră la 30°C.
8.5.2.Înainte de determinarea cromatografică a probelor coloanele trebuie condiţionate prin injectarea repetată a probei standard (5.4.2) în soluţie (8.5.1) până când suprafaţa vârfului şi timpul de retenţie al acestuia pentru GMP sunt constante.
8.5.3.Se determină coeficientul de răspuns R prin injectarea aceluiaşi volum de filtrat (8.5.1) folosit şi în probe.
9.Exprimarea rezultatelor
9.1.Metoda de calcul şi formula
9.1.1.Calcularea factorilor de răspuns R:
Vârful II:
R(II) = 100/A(II)[0]
Vârful IV:
R(IV) = 100/A(IV)[0]
unde:
R(II) şi R(IV) = factorii de răspuns pentru vârfurile II şi respectiv IV,
A(II)[0] şi A(IV)[0] = suprafeţele vârfurilor II şi respectiv IV pentru proba etalon [0] obţinute la 8.5.3.
Vârful III:
R(III) = W/A(III)[5] - A(III)[0]
unde:
R(III) = coeficientul de răspuns al vârfului III,
A(III)[0] şi A(III)[5] = suprafeţele vârfurilor III pentru probele etalon [0] şi respectiv [5] obţinute la 8.5.3,
W = cantitatea de zer din proba etalon [5] adică 5.
9.1.2.Calcularea suprafeţei relative a vârfurilor probei [E]:
S(II)[E] = R(II) x A(II)[E]
S(III)[E] = R(III) x A(III)[E]
S(IV)[E] = R(IV) x A(IV)[E]
unde:
S(II)[E], S(III)[E], S(IV)[E] = suprafeţele relative ale vârfurilor II, III şi respectiv IV din proba [E],
A(II)[E], A(III)[E], A(IV)[E] = suprafeţele vârfurilor II, III şi respectiv IV din probă [E] obţinute la 8.4.2.
R(II), R(III), R(IV) = coeficientul de răspuns calculat al 9.1.1.
9.1.3.Calcularea timpului relativ de retenţie al vârfului III pentru proba [E]:
RRT(III)[E] = RT(III)[E]/RT(III)[5]
unde:
RRT(III)[E] = timpul relativ de retenţie al vârfului III din proba [E],
RT(III)[E] = timpul relativ de retenţie al vârfului III din proba [E] obţinut la 8.4.2,
RT(III)[5] = timpul relativ de retenţie al vârfului III din proba de control [5] obţinut la 8.5.3.
9.1.4.Experimentele au demonstrat că există o relaţie liniară între timpul relativ de retenţie al vârfului III, adică RRT(III)[E] şi procentul de zer praf de până la 10% adăugat.
- RRT [E] este < 1,000 dacă conţinutul de zer este > 5%;
- RRT [E] este > 1,000 dacă conţinutul de zer este =< 5%.
Nesiguranţa permisă pentru valorile RRT(III) este de ± 0,002.
În mod normal, valoarea RRT(III)[0] deviază puţin de la 1,034. În funcţie de starea coloanelor, valoarea se poate apropia de 1,000, dar este întotdeauna mai mare de această valoare.
9.2.Calcularea procentului de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor praf din probă:
W = S(III)[E] - [1,3 + (S(III)[0]) - 0,9]
unde:
W = procentul m/m de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui la fabricarea brânzeturilor în proba [E],
S(III)[E] = suprafaţa relativă a vârfului III al probei analizate [E] obţinută la 9.1.2,
1,3 reprezintă suprafaţa medie relativă a vârfului III exprimată în grame de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor pe 100 g determinată pentru lapte praf degresat nemodificat cu diferite origini. Această valoare a fost obţinută experimental,
S(III)[0] reprezintă suprafaţa relativă a vârfului III egală cu R(III) x A(III)[0]. Aceste valori au fost obţinute la 9.1.1. şi respectiv 8.5.3,
(S(III)[0] - 0,9) reprezintă corecţia care trebuie adusă suprafeţei relative 1,3 când S(III)[0] nu are valoarea 0,9. În mod experimental, suprafaţa medie relativă a vârfului III al probei martor [0] este de 0,9.
9.3.Precizia procedurii
9.3.1.Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate simultan sau în succesiune rapidă de către acelaşi operator, folosind aceeaşi aparatură şi material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,2% m/m.
9.3.2.Reproductibilitate
Diferenţa dintre două rezultate separate şi independente, obţinute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,4% m/m.
9.4.Interpretare
9.4.1.Se presupune că zerul este absent dacă suprafaţa relativă a vârfului III, S(III)[E] exprimată în grame de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor pe o sută de grame de produs este =< 2,0 + (S(III)[0] - 0,9)
unde:
2,0 este valoarea maximă permisă a suprafeţei relative a vârfului III avându-se în vedere suprafaţa relativă a vârfului III, adică 1,3 nesiguranţa datorată variaţiilor compoziţiei laptelui praf degresat şi reproductibilitatea metodei (9.3.2),
(S(III)[0] - 0,9) este corecţia care trebuie adusă când suprafaţa S(III)[0] nu este 0,9 (vezi pct. 9.2).
9.4.2.Dacă suprafaţa relativă a vârfului III, S(III)[E] este > 2,0 + (S(III)[0]) - 0,9) şi suprafaţa relativă a vârfului II, S(II)[E] =< 160, se determină conţinutul de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor conform indicaţiilor de la pct. 9.2.
9.4.3.Dacă suprafaţa relativă a vârfului III, S(III)[E] este > 2,0 + (S(III)[0] - 0,9) şi suprafaţa relativă a vârfului II, S(II)[E] =< 160, se determină conţinutul total de proteine (P%); apoi se examinează graficele 1 şi 2.
9.4.3.1.Datele obţinute în urma analizei probelor de lapte praf degresat nemodificat cu un conţinut total de proteine ridicat sunt reprezentate în graficele 1 şi 2.
Linia continuă reprezintă regresia liniară, ai cărei coeficienţi se calculează prin metoda celor mai mici pătrate.
Linia dreaptă punctată marchează limita superioară a suprafeţei relative a vârfului III, cu probabilitatea ca aceasta să nu fie depăşită 90% din cazuri.
Ecuaţiile liniilor drepte punctate de pe graficele 1 şi 2 sunt:
S(III) = 0,376 * P% - 10,7 (graficul 1), şi respectiv
S(III) = 0,0123 * S(II)[E] + 0,93 (graficul 2).
unde:
S(III) este suprafaţa relativă a vârfului III calculată fie pe baza conţinutului total de proteine, fie pe baza suprafeţei relative a vârfului S(II)[E],
P% este conţinutul total de proteine exprimat ca procent de masă,
S(II)[E] este suprafaţa relativă pentru probă calculată la pct. 9.1.2.
Pe baza acestor ecuaţii rezultă graficele din figura 1.3, menţionate la 9.2.
Diferenţa (T1 şi T2) dintre suprafaţa relativă S(III)[E] determinată şi suprafaţa relativă S(III) se calculează după cum urmează:
T1 = S(III)[E] - [(0,376 * P% - 10,7) + (S(III)[0] - 0,9)];
T2 = S(III)[E] - [(0,123 * S(II)[E] + 0.93) + (S(III)[0] - 0,9)].
9.4.3.2.Dacă T1 şi/sau T2 au valoarea zero sau mai mică, nu se poate determina prezenţa zerului închegat.
Dacă T1 sau T2 au o valoare mai mare de zero, zerul obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor este prezent.
Conţinutul de zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor se calculează cu ajutorul formulei:
W = T2 + 0,91
unde:
0,91 este distanţa pe axa verticală între linia dreaptă continuă şi linia dreaptă punctată.
LAPTE PRAF DEGRESAT
Pe ordonată: Vârful III
Pe abscisă: conţinut total de proteine (%)
LAPTE PRAF DEGRESAT
Pe ordonată: Vârful III
Pe abscisă: Vârful II.
ANEXA Nr. XVIII:DETERMINAREA SUBSTANŢELOR SUBSTANŢĂ USCATĂ DIN ZER OBŢINUT DE LA ÎNCHEGAREA CU CHEAG A LAPTELUI, LA FABRICAREA BRÂNZETURILOR ÎN LAPTELE PRAF DEGRESAT ŞI ÎN AMESTECURILE MENŢIONATE ÎN REGULAMENTUL (CE) NR. 2.799/1999
1.Scop: Detectarea substanţelor
Substanţă uscată din zer praf adăugate în:
a)laptele praf degresat;
b)amestecuri, aşa cum sunt definite în art. 4 din Regulamentul (CE) nr. 2.799/1999.
2.Referinţe: Standardul internaţional ISO 707.
3.Definiţii
a)laptele praf degresat: obţinut prin eliminarea apei din lapte, cu un conţinut maxim de 11% grăsime şi 5% apă, şi cu un conţinut de substanţe proteice în substanţa uscată negrasă mai mic de 31,4%;
b)amestecuri;
c)Conţinutul de substanţă uscată Substanţă uscată din zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor se defineşte ca procent de masă determinat prin procedura descrisă.
4.Principiu
Conţinutul de glicomacropeptide A se determină conform anexei XVIII. Probele pentru care se obţin rezultate pozitive se analizează pentru detectarea glicomacropeptidelor A prin procedura de cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversată (procedura HPLC). Evaluarea rezultatelor se face prin referire la probe etalon formate din lapte praf degresat care conţin sau nu conţin un procent cunoscut de zer praf. Rezultatele mai mari de 1% (m/m) indică prezenţa substanţelor Substanţă uscată din zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor.
5.Reactivi
Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă. Acetonitrilul trebuie să fie de calitate spectroscopică sau de calitate HPLC.
Reactivii necesari pentru această procedură sunt descrişi în anexa XVIII la prezentul regulament.
Reactivi pentru HPLC în fază inversată.
5.1.Soluţie de acid tricloracetic
Se dizolvă în apă 240 g acid tricloracetic (CCl3CCOOH) şi se completează cu apă până la 1.000 ml.
5.2.Eluanţii A şi B
Eluantul A: Se introduc într-un balon cotat de 1.000 ml 150 ml acetonitril (CH3CHOHCH3) şi 1,00 ml de acid tricloracetic (TFA, CF3COOH). Se completează cu apă până la 1.000 ml.
Eluantul B: Se introduc într-un balon cotat de 1.000 ml 550 ml acetonitril, 20 ml izopropanol şi 1,00 ml TFA. Se completează cu apă până la 1.000 ml. Soluţia eluantă se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu pori cu diametrul de 0,45 µ.m.
5.3.Conservarea coloanei
După analize, coloana se clăteşte cu eluantul B (cu un gradient) iar apoi se clăteşte cu acetonitril (cu un gradient timp de 30 minute). Coloana se păstrează în acetonitril.
5.4.Probele etalon
5.4.1.Lapte praf degresat care îndeplineşte cerinţele pentru depozitare publică (adică (0)).
5.4.2.Acelaşi lapte praf degresat, modificat cu 5% (m/m) zer praf cu compoziţie standard (adică (5)).
5.4.3.Acelaşi lapte praf degresat, modificat cu 5% (m/m) zer praf cu compoziţie standard (adică (50))1).
1)Zerul praf cu compoziţie standard precum şi laptele praf degresat modificat pot fi procurate de la NIZO, Kemhemseweg 2, PO Box 20 - NL-6710 BA. Se pot totuşi folosi şi prafuri care produc rezultate echivalente celor obţinute pentru produsele NIZO.
6.Aparatură
Aparatura necesară pentru procedura descrisă este cea descrisă în anexa XVIII la prezentul regulament.
6.1.Balanţă analitică.
6.2.Centrifugă capabilă să realizeze o acceleraţie de 2.200 g, prevăzută cu tuburi cu capac pentru centrifugare, cu o capacitate de aproximativ 50 ml.
6.3.Agitator mecanic cu care se pot agita preparate la 50°C.
6.4.Agitator magnetic.
6.5.Coloane de sticlă cu diametrul de aproximativ 7 cm.
6.6.Filtre de hârtie care asigură o viteză medie de filtrare cu diametrul de aproximativ 12,5 cm.
6.7.Dispozitiv de sticlă pentru filtrare prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 µm.
6.8.Pipete gradate de 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835), sau un sistem prin care pot trece 10,0 ml în două minute.
6.9.Baie termostat de apă, reglată la 25 ± 0,5°C.
6.10.Echipament pentru HPLC format din:
6.10.1. Sistem binar de pompare reglabil.
6.10.2. Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 100 µl.
6.10.3. Coloană Dupont Protein Plus (lungime 25 cm, diametru intern 0,46 cm) sau o coloană în fază inversată cu pori mari pe bază de silice echivalentă.
6.10.4. Termostat pentru coloană, reglat la 35 ± 1°C.
6.10.5. Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite realizarea de măsurători la 210 nm (dacă este necesar se poate folosi o lungime de undă mai mare, de până la 220 nm) cu o sensibilitate de 0,02 A.
6.10.6. Integrator cu ajutorul căruia, se poate realiza integrarea la linia de bază.
Observaţie: Se poate lucra cu coloana la temperatura camerei, cu condiţia ca temperatura să nu varieze cu mai mult de 1°C; în caz contrar se înregistrează o variaţie mult prea mare a timpului de retenţie al GMP(A).
7.Prevalarea probelor
7.1.Probele se prevalează conform procedurii descrise de Standardul internaţional ISO 707. Totuşi, statele membre pot folosi şi altă metodă de prelevare a probelor, cu condiţia ca aceasta să respecte principiile standardului menţionat anterior.
7.2.Probele se depozitează în condiţii în care nu poate interveni nici o deteriorare sau modificare a compoziţiei.
8.Procedură
8.1.Prepararea probei de analiză
Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ triplă faţă de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanş la aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.
8.2.Cantitatea analizată
Se cântăresc 2.000 + 0.001 g din proba analizată într-un tub de centrifugare (6.2) sau într-un balon cu dop adecvat (50 ml).
8.3.Îndepărtarea grăsimii şi a proteinelor
8.3.1.Se adaugă 20,0 g de apă caldă (50°C) la cantitatea analizată. Se dizolvă laptele praf agitându-se cinci minute sau 30 de minute în cazul zarei acide cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se introduce în baia de apă (6.9) şi se lasă să se echilibreze la 25°C.
8.3.2.Se adaugă continuu 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (5,1) timp două minute, amestecându-se puternic cu ajutorul unui agitator magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.9) şi se lasă timp de 60 de minute.
8.3.3.Se centrifughează (6.2) timp de 10 minute sau se filtrează prin hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat.
8.4.Determinarea cromatografică
8.4.1.Se efectueuză analiza HPLC conform descrierii din anexa XVIII. Dacă se obţine un rezultat negativ, proba analizată nu conţine Substanţă uscată din zer praf în cantităţi detectabile. Dacă rezultatul este pozitiv, se aplică procedura HPLC în faza inversată descrisă mai jos. Prezenţa zarei acide praf poate provoca apariţia unor rezultate fals pozitive. Metoda HPLC în fază inversă exclude această posibilitate.
8.4.2.Înainte de realizarea analizei HPLC în fază inversă se optimizează condiţiile de gradient. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort de aproximativ 6 ml (volum de la punctul în care solvenţii se întâlnesc până la bucla injectorului, inclusiv) timpul de retenţie de 26 ± 2 minute pentru GMPA este optim. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort mai mic (de exemplu 2 ml) timpul optim de retenţie este de 22 minute.
Se recoltează soluţii de probă etalon (5.4) cu şi fără 50% zer praf.
Se injectează 100 µl de supranatant sau de filtrat (8.3.3) în sistemul HPLC care funcţionează în condiţiile de gradient de explorare din tabelul 1.
Tabelul 1
Condiţii de gradient de explorare pentru optimizarea cromatografiei
Timp | Flux | % A | % B | Curba |
(minute) | (ml/minut) | |||
Iniţial | 1,0 | 90 | 10 | * |
27 | 1,0 | 60 | 40 | lin |
32 | 1,0 | 10 | 90 | lin |
37 | 1,0 | 10 | 90 | lin |
42 | 1,0 | 90 | 10 | lin |
Compararea celor două cromatograme trebuie să indice poziţia vârfului (vârful (GMP(A)).
Cu ajutorul formulei de mai jos se poate calcula compoziţia iniţială a solventului care se foloseşte pentru gradientul normal (vezi 8.4.3).
% B = 10 - 2,5 - + (13,5 + (RTgmpA - 26)/6) * 30/27
% B = 7,5 + (13,5 + (RTgmpA - 26)/6) * 1,11
unde:
RTgmpA: timpul de retenţie al GMP(A) la gradientul de explorare,
10: % B iniţial al gradientului de explorare,
2,5: % B în punctul de mijloc minus % B iniţial la gradientul normal,
13,5: timpul corespunzător punctului de mijloc,
26: timpul necesar de retenţie pentru GMP(A),
6: raportul pantelor gradienţilor de explorare şi normal,
30: % B iniţial minus % B la 27 minute la gradientul de explorare,
27: timpul de rulare al gradientului de explorare.
8.4.3.Prelevarea soluţiilor din probele analizate
Se injectează 100 µl de supernatant sau filtrat (8.3.3) măsurat cu precizie în aparatul HPLC funcţionând la un debit de 1,0 ml de soluţie eluantă (5.2) pe minut.
Compoziţia eluantului la începutul analizei se obţine ca la pct. 8.4.2. În mod normal este de aproximativ A:B = 76:24 (5.2). Imediat după injectare se porneşte un gradient liniar, rezultatul fiind un procent al B cu 5% mai mare peste 27 minute. Apoi se porneşte un gradient liniar, datorită căruia, după cinci minute, compoziţia eluantului este de 90% B. Compoziţia se menţine timp de cinci minute, după care compoziţia se modifică în cinci minute, via un gradient liniar, ajungând la compoziţia iniţială. În funcţie de volumul intern al sistemului de pompare, următoarea injectare se poate face la 15 minute după ce se ajunge la condiţiile iniţiale.
Observaţii:
1.Timpul de retenţie al glicomacropeptidelor trebuie să fie de 26 ± două minute. Acesta se poate obţine prin modificarea condiţiilor iniţiale şi finale ale primului gradient. Totuşi, diferenţa la nivelul % B în condiţiile iniţiale şi finale ale primului gradient trebuie să se menţină la 5% B.
2.Eluanţii trebuie degazaţi suficient şi trebuie de asemenea să se menţină degazaţi. Acest lucru este esenţial pentru buna funcţionare a sistemului de pompare reglabil. Deviaţia standard a timpului de retenţie al vârfului GMP trebuie să fie sub 0,1 minute (n = 10).
3.După fiecare cinci probe se injectează proba de referinţă (5) şi se foloseşte pentru calcularea noului coeficient de răspuns R. (9.1.1).
8.4.4.Rezultatele analizei cromatografice a probei analizate (E) se obţin sub forma unei cromatograme în care vârful GMP este identificat pe baza timpului său de retenţie de aproximativ 26 minute.
Integratorul (6.40.6) calculează automat înălţimea vârfului H pentru vârful GMP. Se verifică poziţia liniei de bază în fiecare cromatogramă. Dacă poziţia liniei de bază este incorectă, analiza sau integrarea se repetă.
Este extrem de important să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice eventuale anomalii datorate fie funcţionarii necorespunzătoare a aparatului sau a coloanelor, fie originii sau naturii probei analizate. Dacă există dubii, analiza se repetă.
8.5.Calibrarea
8.5.1.Se aplică cu exactitate procedura descrisă de la pct. 8.2 la pct. 8.4.4 folosindu-se probele etalon (5.4.1 - 5.4.2). Se folosesc soluţii proaspăt preparate, întrucât GMP se degradează într-un mediu 8% tricloracetic la temperatura camerei. La 4°C soluţia este stabilă timp de 24 ore. Pentru seriile lungi de analize este de preferabil ca în injectorul automat să se folosească o tavă răcită pentru probe.
Observaţie: 8.4.2 se poate omite dacă se cunoaşte % B în condiţiile iniţiale din analizele efectuate anterior.
Cromatograma probei de referinţă (5) trebuie să fie similară cu cea din Figura 1. În această figură vârful GMP(A) este precedat de două vârfuri mici. Este extrem de important să se obţină o separare similară.
8.5.2.Înainte de determinarea cromatografică a probei se injectează 100 µl din proba etalon care nu conţine zer obţinut de la închegarea cu cheag a laptelui, la fabricarea brânzeturilor (0) (5.4.1).
Pe cromatogramă nu trebuie să apară un vârf pentru timpul de retenţie al vârfului GMP(A).
8.5.3.Coeficientul de răspuns R se determină prin injectarea aceluiaşi volum de filtrat (8.5.1) ca cel folosit pentru probe.
9.Exprimarea rezultatelor
9.1.Metoda de calcul şi formula
9.1.1.Calcularea coeficientului de răspuns R:
Vârful GMP = W/H
unde:
R - coeficientul de răspuns al vârfului GMP,
H - înălţimea vârfului GMP,
W - cantitatea de zer din proba etalon (5).
9.2.Calcularea procentului de zer praf din probă
W(E) = R x H(E)
unde:
W(E) = procentul (m/m) de zer praf din proba (E),
R = coeficientul de răspuns al vârfului GMP (9.1.1),
H(E) = înălţimea vârfului GMP al probei (E).
Dacă W(E) este mai mare de 1% şi diferenţa dintre timpul de retenţie şi cel al probei standard (5) este mai mic de 0,2 minute, atunci sunt prezente substanţe Substanţă uscată din zer praf.
9.3.Precizia metodei
9.3.1.Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în cel mai scurt interval de timp posibil de acelaşi operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,2% m/m.
9.3.2.Reproductibilitate
Nu s-a determinat încă.
9.3.3.Liniaritate
De la 0 la 16% zer praf se obţine o relaţie de liniaritate cu un coeficient de corelare > 0,99.
9.4.Interpretare
9.4.1.Se consideră că zerul este prezent dacă rezultatul obţinut la 9.2 este mai mare de 1% m/m şi timpul de retenţie al vârfului GMP diferă cu mai mult de 0,2 minute de cel al probei etalon (5). Limita de 1% se stabileşte în conformitate cu prevederile de la punctele 9.2 şi 9.4.1 din anexa V la Regulamentul (CEE) nr. 625/78.
Tabel I - Ni-4.6 standard
Tabelul I - Ni-4.6 standard
ordonată: Absorbanţa (220 nm)
abscisă: timp (minute).
ANEXA Nr. XIX:LAPTE PRAF DEGRESAT: DETERMINAREA CANTITATIVĂ A FOSFATIDILSERINEI ŞI A FOSFATIDILETANOLAMINEI
Metodă: HPLC în fază inversă
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a fosfatidilserinei (PS) şi a fosfatidiletanolaminei (PE) din laptele praf degresat (LPD) şi este adecvată pentru determinarea substanţei uscate din zară din LPD.
2.Definiţie
Conţinutul de PS + PE: fracţiunea de masă a substanţei determinate prin procedura descrisă în prezenta anexă. Rezultatul se exprimă în miligrame de dipalmitoil fosfatidiletanolamină (PEDP) în 100 g praf.
3.Principiu
Extragerea aminofosfolipidelor cu metanol din lapte praf reconstituit. Determinare PS şi PE ca derivaţi ai o-ftaldialdehidei (OPA) prin HPLC în fază inversă (RP) şi prin detectare prin fluorescenţă. Cuantificarea conţinutului de PS şi PE din proba analizată prin referire la o probă etalon conţinând o cantitate cunoscută de PEDP.
4.Reactivi
Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă, cu excepţia cazurilor în care se precizează altceva.
4.1.Materialul etalon: PEDP cu o puritate de cel puţin 99%.
NOTĂ: Materialul etalon se depozitează la -18°C.
4.2.Reactivi pentru prepararea probei etalon şi a probei de analiză
4.2.1.Metanol de calitate HPLC
4.2.2.Cloroform de calitate HPLC
4.2.3.Monoclorhidrat de triptamină
4.3.Reactivi pentru derivarea o-ftaldialdehidei
4.3.1.Hidroxid de sodiu, soluţie de apă 12 M
4.3.2.Acid boric, soluţie de apă 0,4 M ajustată cu hidroxid de sodiu până la un pH de 10,0 (4.3.1)
4.3.3.2-mercaptetanol
4.3.4.o-ftaldialdehidă (OPA)
4.4.Solvenţi de eluare HPLC
La prepararea solvenţilor de eluare se folosesc reactivi de calitate HPLC.
4.4.1.Apă de calitate HPLC
4.4.2.Metanol cu puritate fluorimetrică testată
4.4.3.Tetrahidrofuran
4.4.4.Fosfat monosodic
4.4.5.Acetal de sodiu
4.4.6.Acid acetic
5.Aparatură
5.1.Balanţă analitică
5.2.Pahare de laborator cu capacitate de 25 şi 100 ml
5.3.Pipete de 1 şi 10 ml
5.4.Agitator magnetic
5.5.Pipete gradate de 0,2, 0,5 şi 5 ml
5.6.Baloane cotate cu capacitate de 10, 50 şi 100 ml
5.7.Seringi cu capacitate de 20 şi 100 µl
5.8.Baie cu ultrasunete
5.9.Centrifugă care funcţionează la 27.000 x g
5.10.Fiole de sticlă cu capacitate de aproximativ 5 ml
5.11.Cilindru gradat cu capacitate de 25 ml
5.12.Aparat de măsurare a pH-ului
5.13.Echipament HPLC
5.13.1. Sistem de pompare reglabil care poate funcţiona la 1,0 ml/min. la 200 bari
5.13.2. Aparat de prelevare automată de probe cu posibilitate de derivare
5.13.3. Încălzitor de coloană reglat la 30°C
5.13.4. Detector de fluorescenţă reglat la o lungime de undă de excitare de 330 nm şi la o lungime de undă de emisie 440 nm
5.13.5. Integrator sau software de procesare de date care poate măsura suprafaţa vârfului
5.13.6. Licrosferă - 100 coloană (250 x 4,6 mm) sau o coloană echivalentă învelită în octadecilsilan (C 18) cu particule de 5 µm
6.Prelevarea probelor
Prelevarea probelor se realizează conform standardului FIL 50B:1985.
7.Procedura
7.1.Procedura soluţiei etalon intern
Se cântăresc 30,0 ± 0,1 mg de monoclorhidrat de triptamină (4.2.3) într-un balon cotat de 100 ml (5.6) şi se completează cu metanol (4.2.1) până la marcaj. Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluţie într-un balon cotat de 10 ml (5.6) şi se completează cu metanol (4.2.1) până la marcaj pentru a se obţine o concentraţie de triptamină de 0,15 mM.
7.2.Prepararea soluţiei din proba de analiză
Se cântăresc 1,000 ± 0,001 g din proba de LPD într-un pahar de laborator de 25 ml (5.2). Se adaugă cu o pipetă (5.3) 10 ml de apă distilată cu temperatura de 40°C şi se amestecă cu un agitator magnetic (5.4) timp de 30 de minute pentru a se dizolva toate cocoloaşele. Se pipetează 0,2 ml (5.5) din laptele reconstituit într-un balon cotat de 10 ml (5.6), se adaugă 100 µl din soluţia de triptamină de 0,15 mM (7-1) cu ajutorul unei seringi (5.7) şi se completează la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă cu grijă prin răsturnare şi se ţine în baia cu ultrasunete (5.8) timp de 15 minute. Se centrifughează (5.9) la 27.000 x g timp de 10 minute şi se colectează supranatantul într-o fiolă de sticlă (5.10).
NOTĂ: Soluţia probă se depozitează la 4°C până la finalizarea analizei HPLC.
7.3.Prepararea soluţiei etalon extern
Se cântăresc 55,4 g de PEDP (4.1) într-un balon cotat de 50 ml (5.6) şi se adaugă aproximativ 25 ml de cloroform (4.2.2) cu ajutorul unui cilindru gradat (5.11). Se încălzeşte balonul astupat la 50°C şi se amestecă cu atenţie până când se dizolvă PEDP. Balonul se răceşte la 20°C şi se completează la volum cu metanol (4.2.1) şi se amestecă prin răsturnare. Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluţie într-un balon cotat de 100 ml (5.6) şi se completează la volum cu metanol (4.2.1). Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluţie într-un balon cotat de 10 ml (5.6) şi se adaugă 100 µl (5.7) de soluţie de triptamină de 0,15 mM (7.1) şi se completează la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă prin răsturnare.
NOTĂ: Soluţia probă de referinţă se depozitează la 4°C până la finalizarea analizei HPLC.
7.4.Prepararea reactivului de derivare
Se cântăresc 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) într-un balon cotat de 10 ml (5.6) şi se adaugă 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) şi se amestecă cu atenţie pentru ca OPA să se dizolve. Se completează până la marcaj cu soluţie de acid boric (4.3.2) şi se adaugă 20 µl de 2-mercaptetanol (4.3.3) cu o seringă (5.7).
NOTĂ: Reactivul de derivare se depozitează la 4°C într-o fiolă de culoare închisă rămânând stabil timp de o săptămână.
7.5.Determinarea prin HPLC
7.5.1.Solvenţi de eluare (4.4)
Solventul A:
Soluţie 0,3 mM de fosfat monosodic şi 3 mM de soluţie de acetat de sodiu (ajustată cu acid acetic la un pH de 6,5); metanol; tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v)
Solventul B:
metanol
7.5.2.Gradient de eluare recomandat:
Timp (min) | Solvent A (%) | Solvent B (%) | Debit (ml/min.) |
Iniţial | 40 | 60 | 0 |
0,1 | 40 | 60 | 0,1 |
5,0 | 40 | 60 | 0,1 |
6,0 | 40 | 60 | 1,0 |
6,5 | 40 | 60 | 1,0 |
9,0 | 36 | 64 | 1,0 |
10,0 | 20 | 80 | 1,0 |
11,5 | 16 | 84 | 1,0 |
12,0 | 16 | 84 | 1,0 |
16,0 | 10 | 90 | 1,0 |
19,0 | 0 | 100 | 1,0 |
20,0 | 0 | 100 | 1,0 |
21,0 | 40 | 60 | 1,0 |
29,0 | 40 | 60 | 1,0 |
30,0 | 40 | 60 | 0 |
NOTĂ: Este posibil să fie nevoie de o uşoară modificare a gradientului de eluare pentru a se obţine rezoluţia din Figura 1.
Temperatura coloanei: 30°C.
7.5.3.Volum injectat: 50 µl reactiv de derivare şi 50 µl soluţie probă
7.5.4.Echilibrarea coloanei
Sistemul se porneşte în fiecare zi, se clăteşte coloana cu solvent B 100% timp de 15 minute, apoi se reglează la A:B = 40:60 şi se echilibrează la 1 ml/min. timp de 15 minute. Se lucrează cu o probă martor injectându-se metanol (4.2.1).
NOTĂ: Înainte de o depozitare pe termen lung coloana se clăteşte cu metanol: cloroform = 80:20 (v/v) timp de 30 minute.
7.5.5.Determinarea conţinutului de PS + PE din proba analizată
7.5.6.Se realizează secvenţa de analiză cromatografică lăsându-se un timp constant între seriile de analize pentru a se obţine timpi de reţinere constanţi. Soluţia etalon extern (7.3) se injectează la fiecare 5-10 soluţii probă pentru a se evalua coeficientul de răspuns.
NOTĂ: Coloana se curăţă prin clătire cu solvent B 100% (7.5.10) timp de cel puţin 30 de minute la fiecare 20-25 de serii.
7.6.Modul de integrare
7.6.1.Vârful PEDP
PEDP este eluat ca un singur vârf. Se determină suprafaţa vârfului prin integrare la linia de bază.
7.6.2.Vârful triptaminei
Triptamina este eluată cu un singur vârf (Figura 1). Se determină suprafaţa vârfului prin integrare la linia de bază.
7.6.3.Grupurile de vârfuri ale PS şi PE
În condiţiile descrise (Figura 1), PS eluează sub forma a două vârfuri principale parţial fără rezoluţie precedate de un vârf minor. PE eluează sub forma a trei vârfuri principale parţial fără rezoluţie. Se determină întreaga suprafaţă a fiecărei aglomerări de vârfuri stabilindu-se linia de bază ca în Figura 1.
8.Calcularea şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de PS şi PE din proba analizată se calculează după cum urmează:
C = 55,36 x A1/A2 x T1/T2
unde:
C = Conţinutul de PS sau PE (mg/100 g praf) din proba analizată,
A1 = Suprafaţa vârfului PEDP din soluţia etalon din probă (7.3),
A2 = Suprafaţa vârfului PS sau PE din soluţia din probă (7.2),
T1 = Suprafaţa vârfului triptaminei din soluţia etalon din probă (7.3),
T2 = Suprafaţa vârfului triptaminei din soluţia din probă (7.2).
9.Precizie
Notă: valorile repetabilităţii au fost calculate conform Standardului Internaţional FIL1). Limita orientativă de reproductibilitate a fost calculată conform procedurii definite în anexa III(b) la prezentul document.
1)Standardul Internaţional FIL 135B/1999. Lapte şi produse lactate. Caracteristicile de precizie ale metodei de analiză. Prezentare generală a procedurii de studiu în colaborare.
9.1.Repetabilitate
Derivaţia standard relativă a repetabilităţii, care exprimă variabilitatea rezultatelor independente de analiză, obţinute de acelaşi operator care foloseşte aceeaşi aparatură în aceleaşi condiţii şi probe de analiză identice într-un interval scurt de timp nu trebuie să depăşească relativ 2%. Dacă se obţin două determinări în aceste condiţii, diferenţa relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 6% din media aritmetică a rezultatelor.
9.2.Reproductibilitate
Dacă se realizează două determinări de către operatori din laboratoare diferite care folosesc aparatură diferită în condiţii diferite şi aceeaşi probă de analiză, diferenţa relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 11% din media aritmetică a rezultatelor.
10.Referinţe
10.1.Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampili M., "Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids." Sci. tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
Figura 1: Modelul HPLC al derivaţilor OPA ai fosfatidilserinei (PS) şi ai fosfatidiletanolaminei (PE) în extractul de metanol al laptelui praf reconstituit. Se raportează modul de integrare a vârfurilor PS, PE şi al tirptaminei (etalon intern).
Minute
ANEXA Nr. XX:DETECTAREA ANTIBIOTICELOR ŞI A REZIDUURILOR DE SULFAMIDE/DAPSON DIN LAPTE PRAF DEGRESAT
Se foloseşte un test de selecţie al unui inhibitor microbian în care se foloseşte Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C 953 ca micro-organism de test şi care este suficient de sensibil pentru a detecta 4 µg Benzilpenicilină din lapte şi 100 µg sulfamidină din lapte.
Sunt disponibile şi se pot folosi kituri comerciale pentru analize dacă acestea au sensibilitatea necesară la Benzilpenicilină şi sulfamidină1)
1)Observaţie importantă: La analiza laptelui praf degresat se pot obţine rezultate fals pozitive. De aceea este important să se verifice dacă sistemul nu generează rezultate fals pozitive.
Pentru analiză se foloseşte lapte praf degresat reconstituit (1 g praf + 9 ml apă distilată). Testul se realizează conform Buletinului FIL 258/1991 secţiunea 1 capitolul 2 sau conform instrucţiunilor producătorului kitului pentru analize.
Rezultatele pozitive se interpretează după cum urmează:
1.Se repetă analiza adăugându-se penicilină în sistemul de analiză:
Rezultat pozitiv: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură.
Rezultat negativ: Substanţa inhibitoare este un antibiotic beta-lactam.
2.Se repetă analiza adăugându-se acid p-aminobenzoic în sistemul de analiză:
Rezultat pozitiv: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură.
Rezultat negativ: Substanţa inhibitoare este o/un sulfamidă/dapson.
3.Se repetă analiza adăugându-se penicilinază + acid p-aminobenzoic în sistemul de analiză:
Rezultat pozitiv: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură.
Rezultat negativ: Substanţele inhibitoare sunt un antibiotic beta-lactam şi o/un sulfamidă/dapson.
ANEXA Nr. XXI:DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LAPTELUI PRAF DEGRESAT ÎN FURAJE COMBINATE PRIN COAGULAREA ENZIMATICĂ A PARA-CAZEINEI
1.Scop
Determinarea cantitativă a laptelui praf degresat în furajele combinate prin coagularea enzimatică a para-cazeinei.
2.Domeniu de aplicare
Această metodă se aplică furajelor combinate conţinând cel puţin 10% lapte praf degresat; prezenţa unor cantităţi mari de zară şi/sau de anumite proteine care nu provin din lapte pot duce la apariţia unor interferenţe.
3.Principiul metodei
3.1.Dizolvarea cazeinei conţinute în furajele combinate prin extragere cu soluţie de citrat de sodiu.
3.2.Ajustarea concentraţiei de ioni de calciu la nivelul necesar pentru precipitarea para-cazeinei; se realizează prin adăugarea de para-cazeină închegată obţinută din cazeină.
3.3.Conţinutul de azot al precipitatului de para-cazeină se determină prin metoda Kjeldahl, aşa cum este descrisă în standardul FIL 20A 1986; cantitatea de lapte praf degresat se calculează pe baza unui conţinut minim de cazeină de 27,5% (vezi 9.1).
4.Reactivi
Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă. Cu excepţia cheagului (4.5), toţi reactivii şi toate soluţiile trebuie să nu conţină substanţe azotate.
4.1.Citrat trisodic (soluţie 1% m/v)
4.2.Clorură de calciu (soluţie 2M). Se cântăresc 20,018 g de CaCO3 (puritate analitică) într-un vas de porţelan de dimensiuni adecvate (150-200 ml) sau într-un pahar de laborator. Se acoperă cu apă distilată şi se transferă într-o baie de apă care fierbe. Se adaugă încet 50-60 ml de soluţie de HCl (conc. HCl:apă = 1:1) pentru a dizolva complet carbonatul. Se lasă în baia de apă până CaCl2 se usucă pentru a se elimina HCl care nu a reacţionat. Se transferă cu apa distilată într-un balon cotat de 100 ml şi se aduce la semn. Se măsoară valoarea pH-ului, care nu trebuie să fie mai mică de 4,0. Soluţia se păstrează în frigider.
4.3.Hidroxid de sodiu 0,1 N.
4.4.Acid clorhidric 0,1 N.
4.5.Cheag lichid de viţel (tărie standard de 1:10.000). Se păstrează în frigider la 4 - 6°C.
4.6.Reactivii pentru determinarea cantitativă a azotului conform metodei Kjeldahl descrişi în standardul FIL 20A 1986.
5.Aparatură
Aparatură obişnuită de laborator, cuprinzând:
5.1.Mojar sau omogenizator
5.2.Balanţă analitică
5.3.Centrifugă de masă (2.000 - 3.000 rpm) cu tuburi de 50 ml
5.4.Agitator magnetic cu minimagneţi de 10 - 15 mm
5.5.Pahare de laborator de 150 şi 200 ml
5.6.Baloane de 250 - 500 ml
5.7.Pâlnii de sticlă cu diametru de 60 - 80 mm
5.8.Hârtie de filtru cantitativă pentru filtrare rapidă cu diametrul de 150 mm (S.S. 5892, S.S. 595 1/2)
5.9.Pipete cu diverse volume nominale
5.10.Baie de apă cu termostat la 37°C
5.11.Aparat de măsurare a pH-ului
5.12.Instalaţie Kjeldahl de mineralizare şi distilare cu fitinguri
5.13.Biuretă gradată de 25 ml
5.14.Stropitor de plastic pentru apă distilată
5.15.Spatule din oţel inoxidabil
5.16.Termometre
5.17.Etuvă cu regulator de temperatură
6.Procedura
6.1.Prepararea probei
Se zdrobesc în mojar sau se omogenizează în râşniţă 10-20 g din probă pentru a se obţine amestec omogen.
6.2.Dizolvarea laptelui praf şi separarea rezidului insolubil
6.2.1.Se cântăresc 1,000 ± 0,002 g de furaje combinate bine omogenizate (6.1) direct într-un tub de centrifugare de 50 ml. Se adaugă 30 ml de soluţie de citrat trisodic (4.1) încălzit în prealabil la 45°C. Se amestecă timp de cel puţin cinci minute cu ajutorul unui agitator magnetic.
6.2.2.Se centrifughează la 500 g (2.000-3.000 rpm) timp de 10 minute şi se decantează cu atenţie supranatantul apos limpede într-un pahar de laborator de 150 - 200 ml, pentru a nu se pierde material.
6.2.3.Se realizează încă două extrageri de reziduu prin aceeaşi procedură şi se adaugă extractele la primul.
6.2.4.Dacă se formează un strat de ulei la suprafaţă, se răceşte în frigider până când grosimile se solidifică şi se îndepărtează stratul solid cu o spatulă.
6.3.Coagularea cazeinei cu enzime cheag
6.3.1.Se adaugă prin picurare, sub agitare continuă, 3,4 ml de soluţie saturată de clorură de calciu (4.2) la întregul extract apos (aproximativ 100 ml). Se ajustează pH-ul la 6,4-6,5 cu soluţii de NaOH (4.3) sau de HCl (4.4). Se introduce în baia de apă termostată la 37°C timp de 15-20 minute pentru a se obţine un echilibru salin. Acesta este indicat de o uşoară tulburare.
6.3.2.Lichidul se transferă în unul (sau în două) tuburi de centrifugare şi se centrifughează la 2.000 g timp de 10 minute pentru a se îndepărta substanţele precipitate. Se transferă supranatantul, fără a se spăla sedimentul, în unul (sau în două) tuburi de centrifugare.
6.3.3.Supranatantul se aduce din nou la temperatura de 37°C. Se adaugă prin picurare, sub agitare continuă 0,5 ml de cheag lichid (4.5). Coagularea se produce după unul sau două minute.
6.3.4.Proba se introduce din nou în baia de apă şi se lasă la o temperatură de 37°C timp de 15 minute. Proba se scoate din baie, iar coagulul se sparge prin amestecare. Se centrifughează la 2.000 g timp de 10 minute. Se filtrează supranatantul printr-un filtru de hârtie adecvat1) (Whatman nr. 541 sau echivalent) şi se păstrează filtrul de hârtie. Se spală precipitatul în tubul de centrifugare, prin agitare cu 50 ml de apă la aproximativ 35°C.
1)Se foloseşte o hârtie de filtru cantitativă pentru filtrare rapidă.
Se centrifughează din nou la 2.000 g timp de 10 minute. Supranatantul se filtrează prin filtrul de hârtie păstrat.
6.4.Determinarea azotului din cazeină
6.4.1.După spălare precipitatul se transferă cantitativ în filtrul de hârtie rămas de la 6.3.4, cu ajutorul unei ape distilate. Filtrul de hârtie se transferă în balonul Kjeldahl. Se determină azotul prin metoda Kjeldahl conform standardului FIL 20A 1986.
7.Test cu probă martor
7.1.Periodic se efectuează câte un test cu probă martor folosindu-se o hârtie de filtru cantitativă (5.8) umezită cu un amestec de 90 ml (4.1) de soluţie de citrat de sodiu, 1 ml soluţie saturată de clorură de calciu (4.2), 0,5 ml de cheag lichid (4.5) şi spălat cu 3 x 15 ml de apă distilată înainte de a se mineraliza prin metoda Kjeldahl conform standardului FIL 20A 1986.
7.2.Volumul de acid folosit pentru testul cu probă martor se ia din volumul de acid (4.4) folosit pentru titrarea probei.
8.Test de control
8.1.Pentru testarea procedurii şi a reactivilor menţionaţi anterior se face o determinare pe un furaj combinat standard cu un conţinut cunoscut de lapte praf degresat după cum s-a stabilit în urma studiului în colaborare. Media rezultatelor determinării pentru o probă martor nu trebuie să difere cu mai mult de 1% de cea rezultată din studiul în colaborare.
9.Exprimarea rezultatelor
9.1.Procentul de lapte praf concentrat din furajul combinat se calculează cu ajutorul formulei de mai jos:
unde: N este procentul de azot din para-cazeină; 27,5 este coeficientul de transformare a cazeinei determinate în procentul de lapte praf degresat; 2,81 şi 0,908 sunt coeficienţii de corecţie obţinuţi prin analiza regresiei.
10.Precizia metodei
10.1.Repetabilitate
În cel puţin 95% din cazuri studiate, analiza probelor martor pentru aceeaşi probă realizată de acelaşi operator în acelaşi laborator trebuie să dea rezultate echivalente cu cele pentru o cantitate nu mai mare de 2,3 g de lapte praf degresat în 100 g de furaj combinat.
10.2.Reproductibilitate
În cel puţin 95% din cazuri studiate, analiza probelor martor pentru aceeaşi probă realizată de două laboratoare trebuie să dea rezultate echivalente cu cele pentru o cantitate nu mai mare de 6,5 g de lapte praf degresat în 100 g de furaj combinat.
11.Limita de toleranţă
Valoarea CrD95 (diferenţă critică; 95% limită de încredere) se calculează cu formula (ISO 5725):
(R: reproductibilitate; r: repetabilitate)
Dubla determinare: CrD95 = 4,5 g
Dacă rezultatul analizei chimice diferă de conţinutul declarat de lapte praf degresat cu nu mai mult de 4,5 g (dubla determinare) se consideră că lotul de furaje combinate îndeplineşte dispoziţiile prezentului regulament.
12.Observaţii
12.1.Adăugarea unor procente mari de proteine care nu provin din lapte şi în special de proteine din soia care sunt încălzite împreună cu laptele praf degresat poate genera rezultate prea mari din cauza co-precipitării cu para-cazeina din lapte.
12.2.Adăugarea de zară poate duce la obţinerea unor cifre mai mici din cauza faptului că se determină numai cantitatea negrasă. Adăugarea de zară acidă poate genera rezultate considerabil mai mici din cauza dizolvării incomplete în soluţia de citrat.
12.3.Adăugarea de cel puţin 0,5% lecitină poate de asemenea genera rezultate cu valori mici.
12.4.Încorporarea de lapte praf degresat tratat la temperaturi înalte poate genera obţinerea de valori prea mari din cauza co-precipitării anumitor proteine cu para-cazeina din lapte.
ANEXA Nr. XXII:DETERMINAREA CALITATIVĂ A AMIDONULUI DIN LAPTELE PRAF DEGRESAT, LAPTE PRAF DENATURAT ŞI FURAJE COMBINATE
1.Domeniu de aplicare
Prin această metodă se detectează amidonul utilizat ca marcator în lapte praf denaturat. Limita de detectare a metodei este de aproximativ 0,05 g de amidon în 100 g de probă.
2.Principiu
Reacţia se bazează pe cea folosită în iodometrie:
- fixarea iodului liber din soluţie apoasă de către coloizi,
- absorbţia de către miceliile de amidon şi prin colorare.
3.Reactivi
3.1.Soluţie de iod:
- iod: 1 g,
- iodură de potasiu: 2 g,
- apă distilată: 100 ml.
4.Aparatură
4.1.Balanţă analitică
4.2.Baie de apă
4.3.Eprubete, 25 mm x 200 mm
5.Procedura
Se cântăreşte 1 g din probă şi se transferă într-o eprubetă (4.3).
Se adaugă 20 ml de apă distilată şi se amestecă pentru a se dispersa proba.
Se introduce în baia de apă (4.2) şi se lasă timp de 5 minute.
Se scoate din baia de apă şi se răceşte la temperatura camerei.
Se adaugă 0,5 ml de soluţie de iod (3.1) şi se amestecă, observându-se culoarea rezultată.
6.Exprimarea rezultatelor
Culoarea albastră indică prezenţa amidonului natural în probă.
Dacă proba conţine amidon modificat, poate rezulta o altă culoare decât albastru.
7.Observaţii
Culoarea, intensitatea culorii şi aspectul observat la microscop al amidonului variază în funcţie de originea amidonului natural (de exemplu porumb sau cartof) şi de tipul de amidon modificat din probă.
În prezenţa amidonului modificat culoarea rezultată este violet, roşu sau maro, în funcţie de amploarea modificării din structura cristalină a amidonului natural.
ANEXA Nr. XXIII:DETERMINAREA UMIDITĂŢII DIN ZARA PRAF ACIDĂ
1.Domeniu de aplicare
Determinarea conţinutului de umiditate din zara praf acidă destinată furajelor combinate.
2.Principiu
Proba se usucă în vid. Pierderea de masă se determină prin cântărire.
3.Aparatură
3.1.Balanţă analitică
3.2.Recipiente uscate din metal care nu se corodează sau de sticlă cu capace etanşe la aer; cu un diametru care să permită întinderea probei la aproximativ 0,3 g/cm3.
3.3.Etuvă de vid cu termostat reglabil, prevăzut cu pompă de ulei şi cu un mecanism de introducere a aerului fierbinte, fie ca un agent de uscare (de exemplu oxid de calciu).
3.4.Exicator cu agent de uscare eficient.
3.5.Etuvă cu circulaţie de aer termostatată la 102 ± 2°C.
4.Procedura
Se încălzesc un recipient (3.2) şi capacul acestuia în etuvă (3.5) timp de cel puţin o oră. Se aşează capacul pe recipient şi se transferă imediat în exicator (3.4); se lasă să se răcească la temperatura camerei şi se cântăreşte cu o precizie de 0,5 mg.
Se cântăresc un recipient (3.2) şi capacul acestuia cu o precizie de 0,5 mg. În recipientul cântărit se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 5 g din probă şi se întind uniform. Recipientul fără capac se introduce în etuva cu vid (3.3) preîncălzit la 83°C. Pentru a împiedica scăderea temperaturii din etuvă la o valoare inacceptabilă, recipientul se introduce în etuvă cât mai rapid posibil.
Se reduce presiunea până la 100 Tori (13,3 kPa) şi se lasă să se usuce timp de patru ore la această presiune, fie într-un curent de aer fierbinte şi uscat, fie cu ajutorul unui agent de uscare (aproximativ 300 g la 20 de probe). În al doilea caz, după ce se obţine presiunea recomandată, pompa de vid se deconectează. Timpul de uscare se calculează din momentul în care temperatura etuvei revine la 83°C. Presiunea etuvei se ridică cu grijă până la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide etuva, recipientul se acoperă imediat cu capacul, se scoate din etuvă şi se lasă să se răcească în exicator (3.3) timp de 30 - 45 minute şi se cântăreşte cu o precizie de 1 mg. Se usucă timp de încă 30 de minute în etuvă cu vid (3.3) la 83°C şi se cântăreşte din nou. Diferenţa între cele două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,1% umiditate.
5.Calcul
(E - m) 100/E
unde
E = masa iniţială a probei exprimată în grame,
m = masa probei uscate exprimată în grame.
6.Precizia
6.1.Limita de repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către un operator care utilizează aceleaşi instrumente şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 0,4 g apă/100 g zara praf acidă.
6.2.Limita de reproductibilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de operatori din laboratoare diferite, care utilizează instrumente diferite şi un material de analiză identic nu trebuie să fie mai mare de 0,6 g apă/100 g zara praf acidă.
6.3.Sursa datelor de precizie
Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1995, în cadrul căruia au participat opt laboratoare şi s-au folosit 12 probe (şase duplicate probă martor).
ANEXA Nr. XXIV:METODA DE REFERINŢĂ PENTRU DETECTAREA GRĂSIMILOR STRĂINE ÎN GRĂSIMEA LACTATĂ PRIN CROMATOGRAFIE CU GAZ A TRIGLICERIDELOR - REVIZIA 1
1.Obiect şi domeniu de aplicare
Acest standard descrie o metodă de detectare a grăsimilor străine, atât a grăsimilor vegetale cât şi a grăsimilor animale cum ar fi seul de vită şi untura din grăsimile lactate din lapte sau din produsele lactate prin analiza prin cromatografie cu gaz a trigliceridelor.
Cu ajutorul anumitor formule de trigliceride se detectează calitativ şi cantitativ grăsimile vegetale şi animale din grăsimea pură din lapte indiferent de condiţiile de hrănire sau de lactaţie.
Observaţia 1: Deşi prezenţă acidului butiric (C4) exclusiv în grăsimile din lapte permite estimarea cantitativă a cantităţilor mici până la cele medii de grăsimi din lapte în grăsimile vegetale, informaţiile calitative şi cantitative sunt foarte greu furnizate în cazul adăugării de până la cel puţin 20% (% masă) grăsimi străine la grăsimile pure din lapte din cauza variaţiilor mari ale C4 în intervalul 3,5 - 4,5 (% masă).
Observaţia 2: Rezultatele cantitative se pot obţine practic numai prin analiza trigliceridelor, deoarece conţinutul de sterol al grăsimilor vegetale diferă în funcţie de modul de producţie şi de condiţiile de tratare.
2.Definiţie
Grăsimi străine în grăsimile din lapte: conform acestui standard, grăsimile străine sunt grăsimile vegetale şi grăsimile animale, cu excepţia grăsimilor din lapte.
3.Principiul metodei
După extracţia grăsimii din lapte se prepară o soluţie, "de bază". Din această soluţie se determină trigliceridele (număr total de atomi de carbon) prin cromatografie cu gaz cu coloane cu umplutură. Prin introducerea % de masă al moleculelor de grăsime de diferite dimensiuni (C24-C54 - numai numere pare) în formula trigliceridelor, grăsimile străine sunt fie detectate calitativ, fie determinate cantitativ.
Observaţie: Pe baza evaluării descrise în prezentul document se poate folosi cromatografia cu gaz cu coloană capilară dacă se poate garanta obţinerea de rezultate similare1).
1)Metodele adecvate sunt deja descrise, a se vedea D. Precht şi J. Molkentin: Quantitative trygliceride analysis using short capillary columns. Chrompack News 4, 16-17 (1993).
4.Reactivi
Se folosesc substanţe cu puritate analitică.
4.1.Gaz purtător: azot, grad de puritate > 99,996%.
4.2.Trigliceride standard2) saturate, precum şi colesterol pentru standardizarea unei grăsimi de referinţă din lapte conform secţiunii 6.5.4.
2)În comerţ sunt disponibile produse adecvate.
4.3.Metanol fără apă
4.4.n-Hexan
4.5.n-Heptan
4.6.Toluen
4.7.Soluţie de dimetilclorsilan: 50 ml de dimetilclorsilan se dizolvă în 283 ml de toluen
4.8.Gaz combustibil: hidrogen şi aer sintetic
4.9.Fază staţionară, 3-% OV-1 la 125/150 µm (100/120 mesh) Gas ChromQ.1)
1)Denumiri comerciale cum sunt Extrelut, Gas ChromQ. Chrompack sunt exemple de produse adecvate disponibile în comerţul specializat. Această informaţie este destinată uşurării folosirii standardului de către utilizator şi nu constituie o cerinţă a produsului. Indicaţiile privind granulaţia au fost transformate în unităţi şi µm conform BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves".
4.10.Soluţie de unt de cocos 10%
5.Aparatură
Aparatură obişnuită de laborator, în special următoarele:
5.1.Cromatograf cu gaz cu temperatură înaltă adecvat pentru temperaturi de cel puţin 400 - 450°C, prevăzut cu detector cu ionizare în flacără şi dispozitiv de control al fluxului de masă constant pentru gazul vector. Gaz de ardere: 30 ml/min. H2, 270 ml/min. aer sintetic.
Având în vedere debitul mare al gazului purtător, jetul de flacără trebuie să fie extrem de mare.
Observaţie: Din cauza temperaturii înalte care se produce în timpul analizei trigliceridelor, racordurile de sticlă ale detectorului cu ionizare în flacără sau ale sistemului de injectare trebuie curăţate frecvent.
Cromatograful cu gaz trebuie să fie prevăzut cu pereţi despărţitori, rezistenţi la temperaturi înalte, care să poată fi folosiţi frecvent şi să prezinte în general un grad foarte redus de "curgere".
Observaţie: Sunt adecvaţi pereţii despărţitori Chromblue (tm) (Chrompack).
Pereţii despărţitori trebuie înlocuiţi la intervale regulate, de exemplu după aproximativ 100 de injectări sau imediat ce rezoluţia este afectată (vezi figura 4).
5.2.Coloana de cromatografie
Coloana de sticlă în formă de U (diametru interior de 2 mm, lungime de 500 mm), silanizată conform secţiunii 6.1 cu dimetilclorsilan pentru dezactivarea suprafeţei de sticlă.
Observaţie: Sunt adecvate şi coloanele mai lungi (80 - 200 mm lungime) acoperite. Cu ajutorul acestora se poate obţine o reproductibilitate a rezultatelor puţin mai bună. Pe de altă parte, faza staţionară prezintă uneori rupturi după operaţiune, care, la rândul lor, ar putea determina rezultate cantitative de calitate mai slabe. În plus, flacăra detectorului cu ionizare în flacăra se stinge cu uşurinţă din cauza fluxului extrem de puternic de gaz purtător care este necesar de 75 - 85 ml/min.
5.3.Modul de umplere a coloanei (vezi figura 1)
Figura 1
Umplerea coloanei
Coloana de sticlă care trebuie umplută.
5.3.1.Coloană de plastic cu capace terminale înşurubate, prevăzute cu un marcaj până la care se poate umple cu fază staţionară.
5.3.2.Site fine (dimensiunea ochiurilor aproximativ 100 µm) cu capac înşurubat, adecvat pentru sigilarea coloanei de sticlă după cum se arată în figura 1.
5.3.3.Vată de sticlă dezactivată silanizată.
5.3.4.Vibrator pentru distribuirea uniformă a fazei staţionare în timpul umplerii.
5.4.Coloană Extrelut1) de 1 - 3 ml cu silicagel. Această coloană poate fi folosită alternativ pentru extracţie în vederea obţinerii de grăsimi din lapte.
5.5.Garnitură de grafit de 6,4 mm (1/4'') cu diametru interior de 6 mm.
5.6.Dispozitive pentru silanizarea suprafeţei de sticlă a coloanei conform secţiunii 6.1.
5.6.1.Vas Woulff
5.6.2.Trompă de vid
5.7.Baie de apă reglabilă la (50 ± 2)°C
5.8.Etuvă reglabilă la (50 ± 2)°C şi la (100 ± 2)°C
5.9.Micropipetă
5.10.Pipetă gradată de 5 ml pentru dozarea a 1,5 ml de metanol
5.11.Balon cu fund rotund de 50 ml
5.12.Balon Erlenmeyer, cu volum nominal de 50 ml
5.13.Pâlnie
5.14.Filtru cu pori fini
5.15.Evaporator rotativ
5.16.Fiole cu volum nominal de 1 ml care pot fi sigilate cu capac de aluminiu şi protejat la interior cu cauciuc.
5.17.Seringă pentru injectare, sistemul de injectare a seringii folosite nu trebuie să ajungă la vârful acului.
Observaţie: Aceste seringi favorizează o mai bună reproductibilitate a rezultatelor care se vor obţine.
Pentru a se evita deteriorarea stratului de cauciuc, vârful acului trebuie verificat la intervale regulate (de exemplu cu un stereomicroscop).
6.Procedura
6.1.Prepararea coloanei (silanizarea)
După conectarea vasului Woulff după cum se arată în figura 2 la pompa de vid, tubul 2 este introdus în soluţie conform secţiunii 4.7. Coloana se umple prin închiderea robinetului; apoi cele două tuburi se îndepărtează.
Figura 2
Dispozitiv pentru silanizare
Pompă de vid
Robinet
Coloana de sticlă
Coloana se fixează pe un stativ şi se umple complet cu dimetildiclorsilan cu ajutorul unei pipete.
După 20-30 min. vasul Woulff se înlocuieşte cu un balon cu filtru iar coloana se goleşte prin conectarea la pompa aspiratoare de apă (vezi figura 3).
6.2.Umplerea coloanei
Se continuă cu clătiri succesive cu 75 ml toluen şi 50 ml metanol; apoi coloana golită se usucă în etuvă la 100°C timp de aproximativ 30 de minute.
Figura 3
Ansamblu de clătire
Pentru umplerea coloanei se foloseşte ansamblul prezentat în figura 1. Coloana de plastic se umple până la marcaj cu faza staţionară conform 4.9. Partea inferioară a coloanei de sticlă care urmează să fie umplută se sigilează cu un dop de vată de sticlă de aproximativ 1 cm, silanizat în prealabil care este apăsat cu o tijă de oţel. Apoi capătul coloanei este închis cu sita conform secţiunii 5.3.2.
Coloana se umple sub presiune (3 bari cu N2) cu fază staţionară. Pentru a se obţine o umplere uniformă, continuă şi fermă, în timpul umplerii un vibrator va deplasa în sus şi în jos coloana de sticlă. După umplere, în celălalt capăt al coloanei acoperite se introduce un dop solid de vată de sticlă silanizată, iar capetele acestuia rămase în exterior se taie şi dopul se împinge câţiva milimetri în interiorul coloanei cu o spatulă.
6.3.Prepararea probelor
Pentru prepararea probei se foloseşte una dintre următoarele trei metode:
6.3.1.Izolarea grăsimii lactate din unt
Se topesc 5-10 g de unt într-un vas adecvat plasat într-o baie de apă cu temperatura de 50°C conform secţiunii 5.7.
Se încălzesc în etuvă la 50°C un pahar Erlenmeyer şi o pâlnie cu filtru încorporat. Stratul de grăsime din proba de unt topit se filtrează cu ajutorul dispozitivului preîncălzit.
Grăsimile lactate de acest tip nu conţin aproape deloc fosfolipide.
6.3.2.Extracţia fracţiunii de grăsime conform metodei Rose-Gottlieb
Extracţia se realizează conform unuia dintre următoarele standarde FIL 1 C:1987, 16 C:1987, 116 A:1987 sau 22 B:1987.
În cazul acestui tip de grăsime din lapte, fosfolipidele permit obţinerea unui vârf al colesterolului cu aproximativ 0,1% mai mare.
Influenţa asupra spectrului de trigliceride standardizat la 100 cu colesterol este deci neglijabilă.
6.3.3.Extracţia din lapte cu coloană cu silicagel
Se aduc 0,7 ml din proba de lapte la temperatura de 20°C şi se introduc într-o coloană Extrelut de 1-3 ml cu o micropipetă conform secţiunii 5.4 şi se lasă să se distribuie uniform pe gelul de silice timp de aproximativ 5 minute.
Cu ajutorul unei pipete se adaugă 1,5 ml de metanol pentru desfacerea complecşilor de proteine - lipide. În continuare, proba este extrasă 20 ml n-hexan. N-hexanul se adaugă încet în cantităţi mici, iar solventul drenat se colectează într-un balon de 50 ml cu fundul rotund care a fost uscat până la obţinerea unei mase constante cunoscute.
După extracţie coloana se scurge până se goleşte.
Solvenţii din diluant se distilă într-un evaporator rotativ într-o baie de apă cu temperatura între 40 şi 50°C.
Se usucă balonul şi se determină grăsimea rezultată prin cântărire.
Observaţie: Extracţia grăsimilor prin metodele Gerber, Weibull-Bemtrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff sau izolarea grăsimii lactate cu ajutorul unor detergenţi (metoda BDI) nu sunt adecvate pentru analiza trigliceridelor, deoarece pot determina trecerea unor cantităţi mai mici sau mai mari de gliceride sau fosfolipide parţiale în fază grasă.
6.4.Prepararea soluţiei de probă
Pentru cromatografia cu gaz se foloseşte o soluţie 5% de grăsime în n-heptan, obţinută după cum se arată la 6.3. Pentru prepararea acestei soluţii etalon se cântăresc cantităţi din materialul de analiză obţinut după cum se arată în secţiunile 6.3.1 şi 6.3.2 şi se dizolvă în cantităţi corespunzătoare de n-heptan.
Pentru prepararea probelor conform secţiunii 6.3.3, cantitatea de n-heptan care trebuie adăugată la materialul de analiză din balon se calculează pe bază de cântărire, iar cantitatea rămasă se dizolvă.
Se umple o fiolă cu aproximativ 1 ml din soluţia de probă, după cum se arată în secţiunea 5.1.6.
6.5.Determinarea cromatografică a trigliceridelor
La temperaturi înalte de 350°C de eluare a trigliceridelor C52-C56 cu catene lungi se produc creşteri uşoare ale liniei de bază, în special în cazurile în care coloanele nu au fost condiţionate corespunzător la început. Această creştere a liniei de bază la temperaturi înalte poate fi complet evitată fie prin combinarea a două coloane, fie prin corecţia liniei de bază.
În modul compensare sau la folosirea unei singure coloane, precum şi în cazul racordurilor de sticlă ale injectorului şi detectorului, se folosesc garnituri de grafit, aşa cum se arată în secţiunea 5.5.
6.5.1.Corecţia liniei de bază
Pentru evitarea creşterii liniei de bază se foloseşte una dintre următoarele patru metode:
6.5.1.1.Combinaţii de coloane
Se folosesc două coloane acoperite în modul compensare.
6.5.1.2.Corecţia liniei de bază cu ajutorul cromatografului cu gaz.
Creşterea liniei de bază se poate evita prin executarea unei serii cu ajutorul cromatografului cu gaz fără injectarea unei soluţii grase şi fără scăderea ulterioară a liniei de bază stocate.
6.5.1.3.Corecţia liniei de bază cu ajutorul unui software de integrare
Creşterea liniei de bază se poate evita prin executarea unei serii cu ajutorul sistemului de integrare fără injectarea unei soluţii grase şi fără scăderea ulterioară a liniei de bază stocate.
6.5.1.4.Corecţia liniei de bază prin condiţionare adecvată
Dacă condiţionarea iniţială a coloanei este adecvată şi se efectuează 20 de injectări cu soluţii de grăsime lactată, creşterile liniei de bază la temperaturi înalte sunt în mod frecvent atât de mici încât nu sunt necesare corecţiile liniei de bază.
6.5.2.Tehnica de injectare
Pentru evitarea efectului de discriminare se foloseşte tehnica "injectării fierbinţi" în vederea obţinerii unor rezultate cantitative mai bune cu ajutorul componentelor trigliceridice cu punct înalt de fierbere. Soluţia grasă se introduce într-o seringă, iar acul rece al acesteia se încălzeşte în capul injectorului timp de aproximativ trei secunde înainte de injectare. Apoi se injectează rapid conţinutul seringii.
Observaţie: Prin folosirea acestei tehnici de injectare se reduce riscul producerii fenomenului de fracţionare în seringă sau în blocul de injectare. Nu se practică injectarea directă "în coloană" în partea încălzită mai mare a coloanei, deoarece fragmentele de perete despărţitor acumulate aici precum şi contaminările se pot evita cu uşurinţă prin tehnica de mai sus dacă se înlocuieşte în mod regulat racordul injectorului fără a se dezasambla coloana.
Este absolut necesar să se evite îndoirea vârfului acului provocată de alinierea fundului paharului conţinând proba (chiar dacă este greu de observat cu ochiul liber) pentru a nu se distruge peretele despărţitor.
Figura 4
Cromatograma trigliceridică a unei probe de grăsime din lapte
a)rezoluţie slabă din cauza distrugerii peretelui despărţitor;
b)rezoluţie bună.
6.5.3.Condiţionarea coloanei cu umplutură
Pe parcursul etapelor (a) - (c) partea de sus a coloanei nu se conectează la detector pentru a se evita contaminarea.
Coloanele umplute conform secţiunii 6.2 se condiţionează după cum urmează:
a)Flux de N2 40 ml/min timp de 15 minute;
b)Încălzire cu 1 K/min până la 355°C la 10 ml N2/min;
c)Menţinere timp de 12-15 h la 355°C;
d)Două injectări a câte 0,5 µl de soluţie de unt de cocos conform secţiunii 4.10 şi programului de temperatură respectiv;
e)20 de injectări a câte 0,5 µl de soluţie de grăsime din lapte timp de două - trei zile, conform secţiunii 6.4.
Observaţii: Untul de cocos este format aproape în întregime din trigliceride C50-C56 cu punct ridicat de fierbere. Injectarea untului de cocos se realizează în scopul condiţionării speciale a gamei cu catene lungi. Pentru trigliceridele C50-C54 cu punct ridicat de fierbere se pot înregistra coeficienţi de răspuns parţial de până la aproximativ 1,20. În mod normal, în cazul injectărilor repetate de soluţie de grăsime din lapte, se produce o scădere a coeficientului de răspuns care este iniţial mare pentru C50-C54. Pentru trigliceridele cu număr acil-c mic, coeficientul de răspuns este de aproximativ 1. Se pregătesc trei perechi de coloane umplute conform secţiunii 6.2. Perechile condiţionate se verifică prin analiza grăsimilor lactate pentru analize de rutină.
În continuare se foloseşte perechea pentru care se obţine cel mai bun rezultat cantitativ (coeficienţi de răspuns de aproximativ 1). Coloanele pentru care se obţin coeficienţi de răspuns > 1,20 nu se folosesc.
6.5.4.Calibrare
Pentru calibrare se determină coeficienţii de răspuns ai trigliceridelor corespunzătoare, precum şi cei ai colesterolului din grăsimea lactată (grăsime de referinţă) cu ajutorul trigliceridelor de referinţă (cel puţin trigliceridele saturate C24, C30, C36, C42, C48 şi C54 precum şi colesterol; este bine să se adauge şi C50 şi C52). Coeficienţii de răspuns intermediar se obţin prin interpolare matematică.
În fiecare zi se realizează două sau trei calibrări folosindu-se grăsimi de referinţă. Dacă se obţin rezultate aproape identice, se vor obţine rezultate cantitative cu grad mare de reproductibilitate şi la analiza trigliceridelor din probe.
Grăsimea lactată de referinţă are un termen de valabilitate de mai multe luni la o temperatură de depozitare de cel mult -18°C, putând astfel fi utilizată ca etalon.
Observaţie: Coeficientul de răspuns al fiecărui constituent se poate obţine şi prin utilizarea unei grăsimi de referinţă cu o compoziţie de trigliceride atestată, cum este MRC 519 (grăsime din lapte anhidră) care se poate obţine de la Institutul pentru materiale de referinţă şi măsurători, Geel, Belgia).
6.5.5.Programul de temperatură, gazul purtător şi alte condiţii pentru analiza trigliceridelor
Program de temperatură: temperatura iniţială a coloanei 210°C se menţine timp de 1 minut, apoi se programează la 6°C/min până la 350°C şi se menţine timp de cinci minute la temperatura finală.
Temperatura detectorului şi a injectorului: 370°C.
Observaţie: Temperaturile (iniţiale) ale detectorului, injectorului şi etuvei se menţin la un nivel constant (şi pe timpul nopţii, la sfârşit de săptămână şi în perioada sărbătorilor şi concediilor).
Gaz purtător: azot, debit de 40 ml/min.
Observaţie: Dacă se folosesc coloanele de 80 cm, debitul trebuie să fie de cel puţin 75 ml/min N2. Debitul gazului purtător se menţine constant (şi pe timpul nopţii, la sfârşit de săptămână şi în perioada sărbătorilor şi concediilor). Debitul exact al gazului purtător se ajustează astfel încât, independent de lungimea coloanei, C54 să fie eluată la 341°C.
Durata analizei: 29,3 minute.
Volumul injectat: 0,5 µl.
Observaţie: Înainte de fiecare injectare seringa se clăteşte de mai multe ori cu heptan pur.
Condiţii pentru detectorul cu ionizare în flacără: conform secţiunii 5.1.
Observaţie: Detectorul cu ionizare în flacără se porneşte la începutul fiecărei zile de lucru.
7.Integrarea, evaluarea şi controlul condiţiilor de măsurare
Trigliceridele cu număr acil-c impar (2n + 1) se combină cu trigliceridele anterioare cu număr par (2n). Conţinuturile mici mai puţin reproductibile de C56 nu se iau în considerare. Restul trigliceridelor (suprafaţa vârfului) din cromatogramă, inclusiv colesterolul (suprafaţa vârfului apropiat de C24) se înmulţesc cu coeficienţii de răspuns corespunzători ai grăsimii standard (de la ultima calibrare) şi se normalizează global la 100. Astfel se evaluează pe lângă colesterolul liber şi trigliceridele C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C58 şi C54. Rezultatele se exprimă în % de masă (g/100 g).
Evaluarea vârfurilor de pe cromatogramă se realizează cu ajutorul unui integrator care permite reprezentarea liniei de bază. Trebuie să se poată realiza o reintegrare cu parametri de integrare optimizaţi.
În figurile 5 şi 6 sunt prezentate două exemple de cromatograme trigliceridice. În figura 5 este prezentată o cromatogramă care poate fi bine evaluată, în timp ce în figura 6 există o eroare sporadică în gama C50-C54, linia de bază fiind incorectă în comparaţie cu cea din figura 5.
Astfel de erori tipice pot fi detectate cu un grad înalt de precizie şi evitate numai prin folosirea unui integrator cu ajutorul căruia se reprezintă linia de bază.
Figura 5
Cromatogramă trigliceridică a grăsimii din lapte cu linie de bază trasată care poate fi evaluată uşor
Figura 6
Cromatogramă a grăsimii din lapte integrată greşit
integrare greşită
Pentru controlarea condiţiilor de măsurare se pot folosi deviaţiile standard relative (DSR: coeficient de variaţie x 100) din tabelul 1 pentru diferite trigliceride. Acestea au fost calculate în cadrul a 19 analize consecutive realizate pe aceeaşi grăsime lactată.
Tabelul 1
Deviaţiile standard relative (DSR) pentru conţinuturi de trigliceride
Trigliceridă | DSR (%) |
C24 | 10,00 |
C26 | 2,69 |
C28 | 3,03 |
C30 | 1,76 |
C32 | 1,03 |
C34 | 0,79 |
C36 | 0,25 |
C38 | 0,42 |
C40 | 0,20 |
C42 | 0,26 |
C44 | 0,34 |
C46 | 0,37 |
C48 | 0,53 |
C50 | 0,38 |
C52 | 0,54 |
C54 | 0,60 |
Dacă deviaţiile standard relative sunt considerabil mai mari decât valorile din Tabelul 1, condiţiile de cromatografie nu sunt adecvate şi trebuie să se verifice cauciucul protector şi debitul gazului purtător. În plus, este posibil ca particulele mici din peretele despărţitor să se acumuleze sub formă de depuneri pe vata de sticlă de la intrarea în coloană sau este posibil ca aceasta să nu mai fie adecvată pentru utilizare din cauza îmbătrânirii, a influenţelor temperaturii etc. (vezi Figura 3).
Observaţie: Valorile din Tabelul 1 nu sunt obligatorii, ci orientative în vederea controlului calităţii. Totuşi, dacă se acceptă valori mai mari ale DSR, trebuie să se respecte limitele de repetabilitate şi de productibilitate de la pct. 11.
8.Detectarea calitativă a grăsimilor străine
Pentru detectarea grăsimilor străine au fost elaborate formule trigliceridice (tabelul 2), în care valorile S ale grăsimilor pure din lapte pot fluctua. Dacă aceste limite sunt depăşite, se poate considera că există grăsimi străine.
Cea mai sensibilă formulă pentru detectarea adaosurilor de grăsimi animale este, ex.
6,5152 * C26 + 1,2052 * C32 + 1,7336 * C34 + 1,7557 * C36 + 2,2325 * C42 + 2,8006 * C46 + 2,5432 * C52 + 0,9892 * C54 = S
Observaţie: Prin analizarea a 755 de probe diferite de grăsime din lapte s-a stabilit un interval de încredere de 99% cu S = 97,96 - 102,04 pentru probele de grăsime pură din lapte cu o deviaţie standard pentru toate valorile S DS = 0,39897.
Pornind de la compoziţia de trigliceride a unei probe necunoscute de grăsime, o asemenea formulă permite, fără a fi necesar să se folosească un computer, să se verifice într-un mod simplu dacă suma conţinuturilor de trigliceride declarate şi coeficienţii corespunzători nu se încadrează în intervalul 97,96 - 102,04, caz în care este foarte probabil să existe adaosuri de grăsimi străine.
În Tabelul 2 sunt prezentate diferite formule trigliceridice pentru detectarea diferitelor grăsimi străine. Se poate folosi o formulă comună pentru detectarea grăsimilor străine reprezentate de ulei de soia, ulei de floarea soarelui, ulei de măsline, ulei de rapiţă, ulei de in, ulei din germeni de grâu, ulei din germeni de porumb, ulei din seminţe de bumbac şi untură de peşte hidrogenată, a grăsimilor vegetale reprezentate de uleiuri din miez de nucă de cocos şi de palmier, precum şi a uleiului de palmier şi respectiv a seului de vită.
Deoarece şi compoziţia trigliceridică a grăsimilor străine este supusă unor fluctuaţii, au fost folosite până la patru seturi diferite de date asupra trigliceridelor din grăsimile străine obţinute prin măsurători experimentale. (Pentru aceleaşi tipuri de grăsimi străine s-a luat în considerare limita cea mai puţin favorabilă (vezi Tabelul 4)).
Rezultate de aproximativ aceeaşi calitate se pot obţine pentru toate grăsimile străine şi cu ajutorul următoarei "Formule totale":
- 2,7575 * C26 + 6,4077 * C28 + 5,5437 * C32 + 6,2600 * C34 + 8,0108 * C40 - 5,0336 * C42 + 0,6356 * C44 + 6,0171 * C46 = S
Calculele pentru detectarea oricărei combinaţii de grăsimi străine în grăsimea din lapte au arătat că, de exemplu, deşi limita de detectare pentru aceste grăsimi este joasă, adică 2,7% dacă se foloseşte formula pentru untură din Tabelul 2, alte grăsimi cum sunt uleiul de cocos, uleiul de palmier sau grăsimea din sâmburi de palmier ale căror limite de detectare sunt de 26,8, 12,5 şi respectiv 19,3%, pot fi detectate cu ajutorul acestei formule numai dacă aceste substanţe au fost adăugate în cantităţi foarte mari la grăsimea din lapte. Acest lucru este valabil şi pentru celelalte formule din Tabelul 2.
Tabelul 2
Formula trigliceridelor pentru detectarea diverselor grăsimi străine din grăsimea lactată, cu deviaţiile standard SD pentru S
Formula pentru ulei de soia, de floarea soarelui, de măsline, de rapiţă, de in, de germeni de grâu, de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte |
2,0983 x C30 + 0,7288 x C34 + 0,6927 x C36 + 0,6353 x C38 + 3,7452 x C40 - 1,2929 x C42 + 11,3544 x C44 + 1,7013 x C46 + 2,5283 x C50 = 0,38157 |
Formula pentru grăsime de palmier şi grăsime din sâmburi de palmier |
3,7453 x C32 + 1,1134 x C36 + 1,3648 x C38 + 2,1544 x C42 + 0,4273 x C44 + 0,5809 x C46 + 11,1226 x C48 + 1,0306 x C50 + 0,9953 x C52 + 1,2396 x C54 = S; DS = 0,11323 |
Formula pentru ulei de palmier şi seu de vită |
3,6644 x C28 + 5,2297 x C30 - 12,5073 x C32 + 4,4285 x C34 - 0,2010 x C36 + 1,2791 x C38 + 16,7433 x C40 - 4,2714 x C42 + 6,3739 x C46 = S; DS = 0,81094 |
Formula pentru untură |
6,51 x C26 + 1,2052 x C32 + 1,7336 x C34 + 1,7557 x C36 + 2,2325 x C42 + 2,8006 x C46 + 12,5432 x C52 + 0,9892 x C54 = S; DS = 0,39897 |
Astfel, pentru verificarea unei probe necunoscute de grăsime, trebuie să se folosească toate formulele din Tabelul 2 şi Formula totală (2) dacă este posibil ca proba să reprezinte o combinaţie între grăsimea lactată şi una dintre cele 14 tipuri diferite de grăsimi străine sau o combinaţie a acestor grăsimi străine. Dacă, prin introducerea trigliceridei unei probe de grăsime care trebuie analizată, se obţine o valoare S care se situează în afara intervalelor din Tabelul 3 numai pentru una dintre formule, este cel mai probabil ca proba să fie o grăsime modificată din lapte. Detectarea unei grăsimi străine în grăsimea lactată cu ajutorul uneia dintre cele patru formule din Tabelul 2 nu permite formularea unor concluzii privind tipul adaosului de grăsimi străine.
Tabelul 3
Limitele - S pentru grăsimea lactată
Formula de detectare a | Gama S |
Uleiului de soia, de floarea soarelui, de măsline, de rapiţă de in, de germeni de grâu de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte | 98,05 - 101,95 |
Uleiului de cocos şi a grăsimii din sâmburi de palmier | 99,42 - 100,581 |
Uleiului de palmier şi a seului de vită | 95,90 - 104,101 |
Unturii | 97,96 - 102,04 |
Formula totală | 95,68 - 104,32 |
În Tabelul 4 sunt prezentate limitele de detectare a diferitelor grăsimi străine cu o precizie de 99%. În prima coloană sunt enumerate limitele minime de detecţie pentru cele mai bune formule de detectare a grăsimii lactate din Tabelul 2. În a doua coloană sunt enumerate limitele de detecţie pentru formula totală. Deşi limitele sunt puţin mai mari, aceasta este singura formulă necesară pentru detectarea unor cantităţi puţin mai mari de grăsimi străine. Cu ajutorul tuturor formulelor pot fi de asemenea detectate combinaţii ale diferitelor tipuri de grăsimi străine. Intervalele în care variază trigliceridele diferitelor grăsimi străine de acelaşi tip influenţează în mod neglijabil limitele de detectare.
Tabelul 4
Limitele de detectare cu o precizie de 99% a adăugării de grăsime străină în grăsimea lactată în %
Formula individuală | Formula totală | |
Ulei de soia | 2,1 | 4,4 |
Ulei de floarea soarelui | 2,3 | 4,8 |
Ulei de măsline | 2,4 | 4,7 |
Ulei de cocos | 3,5 | 4,3 |
Ulei de palmier | 4,4 | 4,7 |
Grăsime din sâmburi de palmier | 4,6 | 5,9 |
Ulei de rapiţă | 2,0 | 4,4 |
Ulei de in | 2,0 | 4,0 |
Ulei de germeni de grâu | 2,7 | 6,4 |
Ulei de germeni de porumb | 2,2 | 4,5 |
Ulei din seminţe de bumbac | 3,3 | 4,4 |
Untură | 2,7 | 4,7 |
Seu de vită | 5,2 | 5,4 |
Ulei de peşte hidrogenat | 5,4 | 6,1 |
Observaţie: Intervalele S sunt calculate în modul respectiv, presupunându-se doar existenţa unei grăsimi străine, dacă limitele formulei individuale sunt depăşite (vezi Tabelul 4).
9.Determinarea cantitativă a grăsimii străine
Pentru a obţine informaţii cantitative asupra concentraţiei de grăsimi străine dintr-o probă de grăsime lactată, se foloseşte următoarea formulă:
X(%) = 100 * (100 - S)/(100 - S(F)),
X reprezentând cantitatea de grăsime străină necunoscută sau amestecul de grăsimi străine din grăsimea necunoscută din lapte. Valoarea lui S este dată de adăugarea unei grăsimi străine necunoscute prin introducerea de trigliceride ale grăsimii străine/amestecului de grăsime din lapte în formula totală a trigliceridelor de mai sus. Dacă se adaugă o grăsime necunoscută în grăsimea din lapte, valoarea medie S a diferitelor grăsimi străine pentru Formula totală se alege pentru S(F); această valoare medie S se obţine prin introducerea datelor trigliceridelor grăsimilor străine pure în această formulă şi prin calcularea unei valori medii (S(F) = 7,46). Se pot obţine rezultate cantitative de bună calitate pentru orice adaos de grăsime străină şi prin folosirea formulei pentru ulei de palmier/seu de vită (Tabelul 2) şi a valorii medii S(F) de 10,57. Pentru tipurile de grăsimi străine cunoscute se inserează următoarele valori S(F) în formula de mai sus şi se alege formula corespunzătoare pentru grăsimi străine din Tabelul 2:
Tabelul 5
Valorile S(F) pentru diferitele grăsimi străine
Grăsimea străină | S(r) |
Ulei de soia | 8,18 |
Ulei de floarea soarelui | 9,43 |
Ulei de măsline | 12,75 |
Ulei de cocos | 118,13 |
Ulei de palmier | 7,55 |
Ulei de sâmburi de palmier | 112,32 |
Ulei de soia | 3,30 |
Ulei de in | 4,44 |
Ulei de germeni de grâu | 27,45 |
Ulei de germeni de porumb | 9,29 |
Ulei din seminţe de bumbac | 41,18 |
Untură | 177,55 |
Seu de vită | 17,56 |
Ulei de peşte | 64,12 |
10.Gama de aplicare a metodei de detectare
Metoda descrisă se aplică laptelui în vrac şi se bazează pe gradul de reprezentativitate al probelor de grăsime din lapte.
Detectarea extrem de specifică ar putea fi posibilă dacă s-ar elabora formule ca cele descrise mai sus pentru diferite ţări pentru un număr reprezentativ de grăsimi din lapte.
S-ar putea obţine modalităţi de detectare extrem de adecvate dacă în diferitele ţări s-ar stabili formule pentru detectarea unui număr reprezentativ de grăsimi din lapte, aşa cum au fost descrise în prezentul regulament. În acest caz nu ar fi necesară utilizarea unor programe informatice complexe dacă s-ar folosi combinaţiile de trigliceride utilizate în Tabelul 2 şi dacă coeficienţii ar fi recalculaţi prin metoda celor mai mici pătrate.
Prin aplicarea intervalului S, după cum este prezentat în Tabelul 3, formulele au o aplicabilitate generală în anumite condiţii de hrănire cum sunt, de exemplu, hrănirea insuficientă sau în exces a vacilor cu drojdie furajeră sau cu săpun de calciu. Formulele indică în parte o grăsime din lapte modificată numai în cazuri de condiţii extreme de hrănire (de exemplu aport ridicat de ulei pur furajer, administrare masivă de săpun de calciu în combinaţie cu grăsime furajeră, etc.).
Observaţie: Grăsimile lactate fracţionate sunt în general detectate ca grăsime nemodificată din lapte dacă limitele sunt depăşite în condiţiile în care existenţa modificării este doar presupusă. Formulele indică o modificare numai pentru grăsimile lactate fracţionate cu o combinaţie neobişnuită de grăsime din lapte aşa cum este, de exemplu, cazul fracţiunii grele obţinute în urma fracţionării prin metode fizice la temperatură înaltă de aproximativ 30°C cu randament scăzut de câteva procente sau cu fracţionare cu CO2 supracritic.
Totuşi, fracţionarea grăsimii lactate poate fi detectată cu ajutorul altor procedee, cum ar fi Calorimetria diferenţială cu scanare.
11.Precizia metodei
Determinată cu ajutorul grăsimii lactate pe baza formulelor din Tabelul 2 şi a intervalelor S din tabelul 3.
11.1.Repetabilitate
Ca diferenţă a valorilor S a două determinări realizate în cel mai scurt interval de timp posibil de către acelaşi operator, folosind aceeaşi procedură şi probe identice în aceleaşi condiţii (aceeaşi persoană, aceeaşi aparatură/aceleaşi dispozitive, acelaşi laborator).
Tabelul 6
Limitele de repetabilitate (r) pentru diferite formule
Formula de detectare a | r |
Uleiului de soia, de floarea soarelui, de măsline, de rapiţă, de in, de germeni de grâu, de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte | 10,67 |
Grăsimii de palmier şi a grăsimii din sâmburi de palmier | 10,12 |
Uleiului de palmier şi a seului de vită | 11,20 |
Unturii | 10,58 |
Formula totală | 11,49 |
11.2.Reproductibilitate
Ca diferenţă a valorilor S a două determinări realizate de operatori din laboratoare diferite, folosind aceeaşi procedură şi probe identice în condiţii diferite (persoane diferite, aparatură diferită) în momente diferite.
Tabelul 7
Limitele de reproductibilitate (R) pentru diferite formule
Formula de detectare a | R |
Uleiului de soia, de floarea soarelui, de măsline, de rapiţă, de in, de germeni de grâu, de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte | 11,08 |
Grăsimii de palmier şi a grăsimii din sâmburi de palmier | 10,40 |
Uleiului de palmier şi a seului de vită | 11,81 |
Unturii | 10,60 |
Formula totală | 12,07 |
11.3.Diferenţa critică
Diferenţele critice pentru toate intervalele S din Tabelul 3 pot fi calculate (analizate în duplicat) cu ajutorul limitelor de repetabilitate (r) şi de reproductibilitate (R). Valorile respective sunt prezentate în Tabelul 8.
Tabelul 8
Diferenţele critice pentru toate formulele trigliceridice
Formula de detectare a | interval |
Uleiului de soia, de floarea soarelui, de măsline, de rapiţă, de in, de germeni de grâu, de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte | 97,43-102,57 |
Grăsimii de palmier şi a grăsimii din sâmburi de palmier | 99,14-100,86 |
Uleiului de palmier şi a seului de vită | 94,91-105,09 |
Unturii | 97,65-102,35 |
Formula totală | 94,58-105,42 |
11.4.Acceptabilitatea rezultatelor
Toate rezultatele pentru care se operează o corecţie a conţinuturilor de trigliceride C24, C26, C28-C54 cu două zecimale rotunjite precum şi colesterolul trebuie normalizat exact la 100. Rezultatele analizei în duplicat se folosesc pentru a controla repetabilitatea. Dacă diferenţa absolută dintre două rezultate S pentru toate cele 5 formule trigliceridice nu depăşeşte limitele de repetabilitate r din Tabelul 6, cerinţa de repetabilitate este îndeplinită.
Pentru controlul condiţiilor optime de cromatografie cu gaz şi în special pentru controlul calităţii coloanei, trebuie să se garanteze că pentru 10 serii repetate diferenţa dintre valorile S maxime şi ale tuturor celor cinci formule trigliceridice nu depăşeşte intervalul x * r, unde r = 1,58 (pentru 10 serii, vezi literatura (16)) şi nici limitele de repetabilitate r pentru diferitele formule din Tabelul 6.
12.Standarde citate
DIN 10 336: 1994 | Nachweis and Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett einer igaschromatographischen Triglyceridanalyse |
Standardul FIL 1 C:1987 | Milk. Determination of Fat Content - Rose Gottlieb Gravimetric Method |
Standardul FIL 16 C:1987 | Cream. Determination of Fat Content - Rose Gottlieb Gravimetric Method |
Standardul FIL 116 A:1987 | Milk - Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content -Rose Gottlieb Gravimetric Method |
Standardul FIL 22 B:1987 | Iskimmed Milk. Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content - Rose Gottlieb Gravimetric Method |
13.Referinţe
13.1.Comisia Comunităţilor Europene: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis, Doc. No VI/5202/90-EN, VI/2645/91.
13.2.Comisia Comunităţilor Europene: Control of butterfat purity in 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. No VI/4577/93.
13.3.Comisia Comunităţilor Europene: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Doc. No VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.
13.4.TimSM, R.E.: Detection and quantification of non-milk fats in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).
13.5.Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombnationen. 41 406-410 (1986).
13.6.Luf, W., De bază, A. Brandl, E.: Zum Nacweis von Fremdfett in Milchfett uber die Triglyceridanalyse. Osterr. Milchwirtsch. Beilage 5, 42 29/35 (1987).
13.7.Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42 143/157 (1989).
13.8.Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42 119-128 (1990).
13.9.Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42 139/154 (1990).
13.10.Precht, D.: Control of milk fat purity by gaz chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 43 (3) 219-242 (1991).
13.11.Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).
Publicat în Monitorul Oficial cu numărul 421 bis din data de 11 mai 2004
Documente corelate
Dacă doriți să acces la toate documente corelate, autentifică-te în Sintact. Nu ai un cont Sintact? Cere un cont demo »