Regulamentul 771/29-feb-2024 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 152/2009 de stabilire a metodelor de eşantionare şi analiză pentru controlul oficial al furajelor

Mc

:

conţinutul de umiditate al eşantionului (în %). 100 - Mc reprezintă, prin urmare, conţinutul de substanţă uscată al eşantionului (în %).

Rana

:

rezultatul analitic măsurat pe eşantion

R12 %

:

rezultat pentru un furaj cu un conţinut de umiditate de 12 %; a se evalua în raport cu nivelul de reglementare.

3.1.

Moară construită dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, uşor de curăţat, care permite o zdrobire rapidă şi uniformă, fără a provoca încălzire semnificativă, care evită pe cât posibil contactul cu aerul exterior şi care corespunde cerinţelor menţionate la punctele 4.1.1 şi 4.1.2 (de exemplu, micro-mori cu ciocane sau răcite cu apă, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dinţate).

3.2.

Balanţă analitică, cu toleranţă de 1 mg.

3.3.

Recipiente uscate din metal care nu se corodează sau din sticlă cu capace ermetice; suprafaţa de lucru permite împrăştierea eşantionului până la aproximativ 0,3 g/cm².

3.4.

Cuptor izoterm cu încălzire electrică (± 2 °C), ventilat corespunzător şi care asigură o reglare rapidă a temperaturii (¹).

(¹) Pentru uscarea cerealelor, a făinii fine, a tărâţelor şi a făinii grunjoase, cuptorul trebuie să aibă o capacitate termică astfel încât, atunci când este prestabilită la 131 °C, va reveni la temperatura respectivă în mai puţin de 45 de minute după ce în interior a fost plasat un număr maxim de eşantioane de testat, în vederea uscării simultane. Ventilaţia trebuie să fie astfel încât, atunci când un număr cât mai mare de eşantioane de grâu comun pe care le poate conţine sunt supuse uscării timp de două ore, rezultatele diferă de cele obţinute după patru ore de uscare cu mai puţin de 0,15 %.

3.5.

Cuptor vidat cu încălzire electrică, reglabil, dotat cu o pompă de ulei şi cu: fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat, fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu).

3.6.

Desicator cu o placă din metal sau porţelan, groasă, perforată, conţinând un agent de desicare eficient.

3.1.

Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm şi adâncime de aproximativ 3 cm.

3.2.

Termometru cu bulb întărit şi cu tub de expansiune la capătul superior, gradat de la aproximativ 80 °C până la cel puţin 110 °C şi lung de aproximativ 10 cm.

3.3.

Cuvă cu nisip sau plită.

3.4.

Desicator, conţinând un agent de uscare eficient.

3.5.

Balanţă analitică.

m

=

greutatea, în grame, a eşantionului de testat;

m1

=

greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său înainte de încălzire;

m2

=

greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său după încălzire.

3.1.

Sulfat de potasiu.

3.2.

Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO4 5H2O.

3.3.

Zinc granulat.

3.4.

Acid sulfuric, 20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indicator roşu de metil; se dizolvă 300 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol, = 95-96 % (v/v).

3.9.

Soluţie de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluţie de calitate tehnică) = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Piatră ponce granulată, spălată în acid clorhidric şi calcinată.

3.13.

Acetanilidă (m.p. = 114 °C, conţinutul în N = 10,36 %).

3.14.

Zaharoză (fără azot).

3.15.

Acid boric (H3BO3).

3.16.

Soluţie de indicator roşu de metil: se dizolvă 100 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol sau metanol.

3.17.

Soluţie de verde de bromocrezol: se dizolvă 100 mg de verde de bromocrezol în 100 ml de etanol sau metanol.

3.18.

Soluţie de acid boric (10 g/l-40 g/l, în funcţie de aparatura utilizată)

Când se aplică detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii roşu de metil şi bromocrezol trebuie adăugaţi la soluţiile de acid boric. Dacă se prepară 1 litru de soluţie de acid boric, înainte de ajustarea de volum, se adaugă 7 ml de soluţie de indicator roşu de metil (punctul 3.16) şi 10 ml de soluţie verde de bromocrezol (punctul 3.17).

În funcţie de apa utilizată, pH-ul soluţiei de acid boric poate diferi de la lot la lot. pH-ul soluţiei de acid boric trebuie să fie între 4,3 şi 4,7. Adesea este necesară o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substanţă alcalină pentru a obţine un martor pozitiv.

Notă: Adăugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH (punctul 3.11) în 1 litru de acid boric 10 g/l oferă, de obicei, ajustări bune. Soluţia se păstrează la temperatura camerei şi, pe durata păstrării, se protejează de lumină şi de surse de vapori de amoniac.

3.19.

Acid clorhidric, soluţie volumetrică standard, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Notă: Dacă în calcule se fac ajustările necesare, se pot folosi alte concentraţii de soluţii volumetrice (punctele 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 şi 3.19). Concentraţiile se exprimă întotdeauna cu patru zecimale.

8.1.

Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesită un transfer între etapele de dizolvare şi distilare, acest transfer trebuie realizat fără pierderi. Dacă vasul aparatului de distilare nu este prevăzut cu o pâlnie de picurare, se adaugă hidroxidul de sodiu imediat înainte de conectarea vasului la condensator, turnând încet lichidul pe marginea vasului.

8.2.

Dacă produsul de dizolvare se solidifică, se reîncepe determinarea folosind o cantitate mai mare de acid sulfuric (punctul 3.4) decât cea menţionată la punctul 5.1.

8.3.

Pentru produsele cu conţinut scăzut de azot, volumul de acidul sulfuric (punctul 3.7) care trebuie introdus în vasul de colectare poate fi redus, dacă este cazul, la 10 sau 15 ml şi completat până la 25 ml cu apă.

8.4.

Pentru analizele curente, în vederea determinării conţinutului de proteine brute se pot aplica metode alternative de analiză, dar metoda Kjeldahl descrisă în prezenta parte C este metoda de referinţă. Echivalenţa dintre rezultatele obţinute cu metoda alternativă (de exemplu, DUMAS) şi cele obţinute prin metoda de referinţă trebuie demonstrată pentru fiecare matrice în mod individual. Întrucât rezultatele obţinute cu o metodă alternativă, chiar şi după verificarea echivalenţei, pot devia uşor faţă de rezultatele obţinute cu metoda de referinţă, este necesar a menţiona în raportul analitic metoda de analiză utilizată pentru determinarea conţinutului de proteine brute.

3.1.

Soluţie de 4-dimetilaminobenzaldehidă: se dizolvă 1,6 g de 4-DMAB în 100 ml de etanol 96 % şi se adaugă 10 ml de acid clorhidric (20 1,19 g/ml). Acest reactiv se conservă timp de maximum două săptămâni.

3.2.

Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.

Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)6 3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.

Cărbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).

3.5.

Uree, soluţie 0,1 % (greutate/volum).

4.1.

Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

4.2.

Eprubete: 160 × 16 mm cu dopuri de sticlă şlefuită.

4.3.

Spectrofotometru.

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

Ovine

Bovine

Ovine

Ovine

Bovine

Fracţie masică ţintă (mg kg^-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Fracţie masică medie. (mg kg^-1)

4 241

6 993

7 830

9 962

12 071

Deviaţia standard a reproductibilităţii sR (mg kg^-1)

1 141

1 303

985

994

1 711

Deviaţia standard a repetabilităţii sr (mg kg^-1)

723

601

549

712

737

Deviaţia standard relativă a reproductibilităţii RSDR (%)

27

19

13

10

14

Deviaţia standard relativă a repetabilităţii RSDr (%)

17

9

7

7

6

Limita reproductibilităţii, R

[R = 2,8 × sR ]

3 195

3 649

2 759

2 784

4 790

Limita repetabilităţii, r

[r = 2,8 × sr ]

2 024

1 684

1 536

1 994

2 064

MAT 2

MAT 5

MAT 3

MAT 4

MAT 6

Ovine

Bovine

Ovine

Ovine

Bovine

Fracţie masică ţintă (mg kg^-1)

3 000

5 000

7 001

9 036

11 000

Fracţie masică medie. (mg kg^-1)

4 101

6 467

7 890

10 062

11 642

Deviaţia standard a reproductibilităţii sR (mg kg^-1)

706

1 194

675

745

1 378

Deviaţia standard a repetabilităţii sr (mg kg^-1)

570

628

613

196

167

Deviaţia standard relativă a reproductibilităţii RSDR (%)

17

18

9

7

12

Deviaţia standard relativă a repetabilităţii RSDr (%)

14

10

8

2

1

Limita reproductibilităţii, R

[R = 2,8 × sR ]

1 977

3 344

1 889

2 087

3 859

Limita repetabilităţii, r

[r = 2,8 × sr ]

1 596

1 759

1 715

549

467

9.1.

În cazul unui conţinut de uree care depăşeşte 3 %, se reduce greutatea eşantionului la 1 g sau se diluează soluţia iniţială astfel încât să nu fie mai mult de 50 mg de uree în 500 ml.

9.2.

În cazul unui conţinut mic în uree, se creşte greutatea eşantionului atâta timp cât filtratul rămâne transparent şi incolor.

9.3.

Rezultatele de mai sus obţinute în urma studiilor colaborative nu indică o diferenţă semnificativă de precizie între ureea măsurată la 420 nm sau la 435 nm.

3.1.

Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30 %.

3.2.

Acid formic, g (g/g) = 98-100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.

Disulfit de sodiu.

3.5.

Hidroxid de sodiu.

3.6.

Acid 5-sulfosalicilic dihidrat.

3.7.

Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml.

3.8.

Citrat trisodic dihidrat.

3.9.

2,2’-tiodietanol (tiodiglicol).

3.10.

Clorură de sodiu.

3.11.

Ninhidrină.

3.12.

Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 °C.

3.13.

Norleucină sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern.

3.14.

Azot, gaz (< 10 ppm oxigen).

3.15.

1-octanol.

3.16.

Aminoacizi.

3.16.1.

Substanţele standard ale aminoacizilor enumeraţi la punctul 1 (Obiect şi domeniu de aplicare). Compuşi puri care nu conţin deloc apă de cristalizare. Înainte de utilizare, se usucă în vid cu ajutorul P2O5 sau al H2SO4, timp de 1 săptămână.

3.16.2.

Acid cisteic.

3.16.3.

Metionin sulfonă.

3.17.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l:

Se dizolvă 300 g de NaOH (punctul 3.5) în apă şi se completează până la 1 litru.

3.18.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l:

Se dizolvă 40 g de NaOH (punctul 3.5) în apă şi se completează până la 1 litru.

3.19.

Soluţie de acid formic-fenol:

Se amestecă 889 g de acid formic (punctul 3.2) cu 111 g de apă şi se adaugă 4,73 g de fenol (punctul 3.3).

3.20.

Mixtură de hidroliză, c = 6 mol HCl/l conţinând 1 g de fenol/l:

Se adaugă 1 g de fenol (punctul 3.3) la 492 ml de HCl (punctul 3.7) şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.21.

Mixtură de extracţie, c = 0,1 mol HCl/l conţinând 2 % tiodiglicol: se iau 8,2 ml de HCl (punctul 3.7), se diluează cu aproximativ 900 ml de apă, se adaugă 20 ml de tiodiglicol (punctul 3.9) şi se completează cu apă până la 1 litru (nu se amestecă direct 3.7 şi 3.9).

3.22.

Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, = 6 %:

Se dizolvă 60 g de acid 5-sulfosalicilic (punctul 3.6) în apă şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.23.

Mixtură de oxidare (acid performic-fenol):

Se amestecă 0,5 ml de peroxid de hidrogen (punctul 3.1) cu 4,5 ml soluţie de acid formic-fenol (punctul 3.19) într-un mic pahar de laborator. Se incubează la 20-30 °C timp de 1 oră pentru a se forma acid performic, apoi se răceşte în baie de apă cu gheaţă (15 min) înainte de a se adăuga la eşantion.

Atenţie: a se evita contactul cu pielea şi a se purta îmbrăcăminte protectoare.

3.24.

Soluţie tampon de citrat, c = 0,2 mol Na⁺/l, pH 2,20:

Se dizolvă 19,61 g de citrat de sodiu (punctul 3.8), 5 ml de tiodiglicol (punctul 3.9), 1 g de fenol (punctul 3.3) şi 16,50 ml de HCl (punctul 3.7) în aproximativ 800 ml de apă. Se ajustează pH-ul la 2,20. Se completează cu apă până la 1 litru.

3.25.

Soluţii tampon de eluţie, preparate în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat (punctul 4.9).

3.26.

Reactiv ninhidrină, preparat în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat (punctul 4.9).

3.27.

Soluţii etalon de aminoacizi. Aceste soluţii se păstrează la o temperatură sub 5 °C.

3.27.1.

Soluţie etalon stoc de aminoacizi (punctul 3.16.1).

c = 2,5 mol/ml pentru fiecare, în acid clorhidric.

Se pot obţine din surse comerciale.

3.27.2.

Soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă, c = 1,25 mol/ml.

Se dizolvă 0,2115 g de acid cisteic (punctul 3.16.2) şi 0,2265 g de metionin sulfonă (punctul 3.16.3) în soluţie tampon de citrat (punctul 3.24) într-un balon gradat de 1 litru şi se completează până la semn cu soluţie tampon de citrat. Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 12 luni. Această soluţie nu se utilizează dacă soluţia etalon stoc (punctul 3.27.1) conţine acid cisteic şi metionin sulfonă.

3.27.3.

Soluţie etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucină, c = 20 mol/ml.

Se dizolvă 0,6560 g de norleucină (punctul 3.13) în soluţie tampon de citrat (punctul 3.24) într-un balon gradat şi se completează cu soluţie tampon de citrat până la 250 ml. Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 6 luni.

3.27.4.

Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 l de acid cisteic şi metionin sulfonă şi c = 10 nmol/50 l din ceilalţi aminoacizi. Se dizolvă 2,2 g de clorură de sodiu (punctul 3.10) într-un pahar de laborator de 100 ml care conţine 30 ml soluţie tampon de citrat (punctul 3.24). Se adaugă 4,00 ml de soluţie etalon stoc de aminoacizi (punctul 3.27.1), 4,00 ml soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă (punctul 3.27.2) şi 0,50 ml soluţie etalon stoc de etalon intern (punctul 3.27.3), dacă este cazul. Se ajustează pH-ul la valoarea 2,20 cu hidroxid de sodiu (punctul 3.18).

Se transferă cantitativ într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu soluţie tampon de citrat (punctul 3.24) şi se amestecă.

Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 3 luni.

A se vedea şi observaţiile de la punctul 9.1.

3.27.5.

Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate preparată în conformitate cu punctul 5.3.3.1 şi pentru utilizare cu extracte (punctul 5.2). Soluţia de calibrare se prepară în conformitate cu punctul 3.27.4, dar omiţând clorura de sodiu.

Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 3 luni.

4.1.

Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux.

4.2.

Sticlă din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu căptuşeală de cauciuc/teflon (de exemplu, Duran, Schott) pentru utilizare în cuptor.

4.3.

Cuptor cu ventilaţie forţată şi un regulator de temperatură cu precizie mai mare de ± 2 ^oC.

4.4.

pH-metru (cu trei zecimale).

4.5.

Filtru cu membrană (0,22 m).

4.6.

Centrifugă.

4.7.

Evaporator rotativ cu vid.

4.8.

Agitator mecanic sau magnetic.

4.9.

Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloană schimbătoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrină, derivare post-coloană şi detector fotometric.

Coloana este umplută cu răşini de polistiren sulfonat capabile să separe aminoacizii unul de altul, precum şi de materiale care conţin ninhidrină. Fluxul din liniile cu soluţie tampon şi ninhidrină este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de ± 0,5 % în perioada care include atât funcţionarea în vederea calibrării standardului, cât şi analiza eşantionului.

În cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare în care hidrolizatul are o concentraţie de sodiu de c = 0,8 mol/l şi conţine întreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare. Alţi analizori nu oferă o separare satisfăcătoare a anumitor aminoacizi dacă hidrolizatul conţine exces de acid formic şi/sau concentraţii mari de ioni de sodiu. În acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml după hidroliză şi înainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatură maximă de 40 °C.

A

=

aria vârfului, hidrolizat sau extract

B

=

aria vârfului, soluţia etalon de calibrare

C

=

aria vârfului, etalon intern în hidrolizat sau extract

D

=

aria vârfului, etalon intern, soluţia etalon de calibrare

M

=

greutatea molară a aminoacidului determinat

c

=

concentraţia de standard în mol/ml

m

=

greutatea eşantionului (g) (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat sau degresat)

V

=

total hidrolizat în ml (punctul 5.3.4) sau volumul de diluţie total calculat pentru extract, în ml (6.1)

6.1.

Volumul total de diluţie al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor liberi (punctul 5.2) se calculează după cum urmează:

Material de referinţă

Aminoacid

Treonină

Cist(e)ină

Metionină

Lizină

Furaje mixte pentru porcine

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Furaj combinat pentru pui de carne

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Concentrat proteic

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Preamestec

58,42

n = 16

-

90,21

n = 16

98,03

n = 16

n = număr de laboratoare participante

9.1.

Din cauza diferenţelor dintre analizorii de aminoacizi, concentraţiile finale ale soluţiilor de calibrare pentru aminoacizii standard (a se vedea punctele 3.27.4 şi 3.27.5) şi pentru hidrolizat (a se vedea punctul 5.3.4) se consideră orientative.

Intervalul răspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toţi aminoacizii.

Soluţia etalon se diluează cu soluţie tampon de citrat pentru a genera arii de vârf situate la mijlocul intervalului.

9.2.

În cazul în care pentru analizarea hidrolizatelor se foloseşte aparatură de cromatografie lichidă de înaltă performanţă, condiţiile experimentale trebuie optimizate în conformitate cu recomandările fabricantului.

9.3.

Prin aplicarea metodei la furajele combinate sau la preamestecurile care conţin peste 1 % clorură (concentrate, furaje minerale, furaje complementare) poate apărea o subestimare a metioninei, ceea ce necesită un tratament special.

3.1.

Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 S/cm).

3.2.

Substanţă etalon: triptofan (puritate/conţinut > = 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.3.

Substanţă etalon intern: -metil-triptofan (puritate/conţinut > = 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.4.

Hidroxid de bariu octahidratat (se evită expunerea excesivă la aer a Ba(OH)2.8 H2O pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba determinarea) (a se vedea observaţia de la punctul 9.3).

3.5.

Hidroxid de sodiu.

3.6.

Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %.

3.7.

Acid clorhidric, 20 1,19 g/ml.

3.8.

Metanol, de calitate HPLC.

3.9.

Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 °C.

3.10.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l

Se dizolvă 40,0 g de NaOH (punctul 3.5) în apă şi se completează până la 1 litru cu apă (punctul 3.1).

3.11.

Acid clorhidric, c = 6 mol/l:

Se iau 492 ml HCl (punctul 3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.12.

Acid clorhidric, c = 1 mol/l:

Se iau 82 ml HCl (punctul 3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.13.

Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l:

Se iau 8,2 ml HCl (punctul 3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.14.

Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l:

Se iau 34 ml de acid ortofosforic (punctul 3.6) şi se completează până la 1 litru cu apă (punctul 3.1).

3.15.

Soluţie concentrată de triptofan (punctul 3.2), c = 2,50 mol/ml:

Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g de triptofan (punctul 3.2) în acid clorhidric (punctul 3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (punctul 3.13). Se păstrează la - 18 °C timp de maximum 4 săptămâni.

3.16.

Soluţie etalon intern concentrată, c = 2,50 mol/ml:

Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g de -metil-triptofan (punctul 3.3) în acid clorhidric (punctul 3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (punctul 3.13). Se păstrează la - 18 °C timp de maximum 4 săptămâni.

3.17.

Soluţie etalon de calibrare pentru triptofan şi etalon intern:

Se iau 2,00 ml din soluţia concentrată de triptofan (punctul 3.15) şi 2,00 ml din soluţia concentrată de etalon intern (-metil-triptofan) (punctul 3.16). Se diluează cu apă (punctul 3.1) şi metanol (punctul 3.8) până se ajunge la un volum aproximativ egal şi la aproximativ aceeaşi concentraţie de metanol (10-30 %) ca şi hidrolizatul final.

Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.

În timpul preparării se protejează de lumina solară directă.

3.18.

Acid acetic

3.19.

1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol.

3.20.

Etanolamină g (g/g) > 98 %.

3.21.

1 g de soluţie de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (punctul 3.19) în 100 ml de metanol (punctul 3.8).

3.22.

Fază mobilă pentru HPLC: 3,00 g acetic acid (punctul 3.18) + 900 ml apă (punctul 3.1) + 50,0 ml soluţie (punctul 3.21) de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (punctul 3.19) în metanol (punctul 3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la valoarea 5,00 utilizând etanolamină (punctul 3.20). Se completează până la 1 000 ml cu apă (punctul 3.1).

4.1.

Echipament de HPLC cu detector spectrofluorometric.

4.2.

Coloană pentru cromatografie lichidă, 125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 m sau echivalent.

4.3.

pH-metru.

4.4.

Vas de polipropilenă, cu capacitate de 125 ml, cu gât larg şi dop filetat.

4.5.

Filtru cu membrană, 0,45 m.

4.6.

Autoclavă, 110 (± 2) °C, 1.4 (± 0,1) bar.

4.7.

Agitator mecanic sau magnetic.

4.8.

Mixer Vortex.

A

=

aria vârfului etalonului intern, soluţia etalon de calibrare (punctul 3.17)

B

=

suprafaţa vârfului pentru triptofan, extract (punctul 5.2) sau hidrolizat (punctul 5.3)

V1

=

volumul în ml (2 ml) al soluţiei concentrate de triptofan (punctul 3.15) adăugată la soluţia de calibrare (punctul 3.17)

c

=

concentraţia în mol/ml (= 2,50) a soluţiei concentrate de triptofan (punctul 3.15) adăugată la soluţia de calibrare (punctul 3.17)

V2

=

volumul în ml al soluţiei etalon intern concentrate (punctul 3.16) adăugată la extract (punctul 5.2) (= 5,00 ml) sau la hidrolizat (punctul 5.3) (= 2,00 ml)

C

=

aria vârfului etalonului intern, extract (punctul 5.2) sau hidrolizat (punctul 5.3)

D

=

aria vârfului pentru triptofan, soluţia etalon de calibrare (punctul 3.17)

V3

=

volumul în ml (= 2,00 ml) al soluţiei de etalon intern concentrate (punctul 3.16) adăugată la soluţia etalon de calibrare (punctul 3.17)

m

=

greutatea eşantionului în g (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat şi/sau degresat)

M

=

masa molară a triptofanului (= 204,23 g/mol).

Eşantion 1

Furaje pentru porcine

Eşantion 2

Furaje pentru porcine suplimentate cu L-triptofan

Eşantion 3

Furaje concentrate pentru porcine

L

12

12

12

n

Medie (g/kg)

50

2,42

55

3,40

50

4,22

sr [g/kg]

0,05

0,05

0,08

r (g/kg)

0,14

0,14

0,22

CVr [%]

1,9

1,6

1,9

SR [g/kg]

0,15

0,20

0,09

R [g/kg]

0,42

0,56

0,25

CVR [%]

6,3

6,0

2,2

L = numărul de laboratoare care au transmis rezultate

n = numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme)

sr = deviaţia standard a repetabilităţii

SR = deviaţia standard a reproductibilităţii

r = repetabilitate

R = reproductibilitate

CVr = coeficientul de variaţie a repetabilităţii, %

CVR = coeficientul de variaţie a reproductibilităţii, %

Eşantion 4

Amestec de grâu cu soia

Eşantion 5

Amestec de grâu cu soia (= eşantion 4) adăugat cu triptofan (0,457 g/kg)

L

n

12

55

12

60

Medie (g/kg)

0,391

0,931

sr [g/kg]

0,005

0,012

r (g/kg)

0,014

0,034

CVr [%]

1,34

1,34

SR [g/kg]

0,018

0,048

R [g/kg]

0,050

0,134

CVR [%]

4,71

5,11

L = numărul de laboratoare care au transmis rezultate

n = numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme)

sr = deviaţia standard a repetabilităţii

SR = deviaţia standard a reproductibilităţii

r = repetabilitate

R = reproductibilitate

CVr = coeficientul de variaţie a repetabilităţii, %

CVR = coeficientul de variaţie a reproductibilităţii, %

Eşantion 1

Furaje mixte pentru porcine (CRM 117)

Eşantion 2

Făină de peşte cu conţinut mic de grăsimi

(CRM 118)

Eşantion 3

Făină din soia

(CRM 119)

Eşantion 4

Lapte praf degresat

(CRM 120)

L

7

7

7

7

n

25

30

30

30

Medie (g/kg)

2,064

8,801

6,882

5,236

sr [g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r (g/kg)

0,059

0,283

0,249

0,112

CVr [%]

1,04

1,15

1,30

0,76

SR [g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R [g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CVR [%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L = numărul de laboratoare care au transmis rezultate

n = numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme)

sr = deviaţia standard a repetabilităţii

SR = deviaţia standard a reproductibilităţii

r = repetabilitate

R = reproductibilitate

CVr = coeficientul de variaţie a repetabilităţii, %

CVR = coeficientul de variaţie a reproductibilităţii, %

9.1.

Respectarea următoarelor condiţiile speciale de cromatografie poate conduce la o mai bună separare a triptofanului de -metil-triptofan.

Eluţie izocratică urmată de curăţarea coloanei prin gradient:

9.2.

Cromatografia variază în funcţie de tipul de HPLC şi de materialul utilizat la umplerea coloanei. Sistemul ales trebuie să fie capabil să stabilească o separare iniţială de referinţă între triptofan şi etalonul intern. În plus, este important ca produşii de degradare să fie bine separaţi de triptofan şi de etalonul intern. Se efectuează o operaţie de probă pe hidrolizate fără etalon intern pentru a verifica prezenţa impurităţilor la nivelul liniei de bază corespunzătoare etalonului intern. Este important ca durata eluţiei pentru toţi produşii de degradare să fie suficient de lungă, altfel prezenţa unor vârfuri de eluţie întârziate poate interfera cu operaţiile ulterioare de cromatografie.

În cursul operaţiilor, sistemul cromatografic oferă un răspuns linear. Acest răspuns linear se măsoară în condiţii de concentraţie constantă (normalul) a etalonului intern şi de concentraţii variabile a triptofanului. Este important că înălţimea vârfurilor pentru triptofan şi pentru etalonul intern să se situeze în gama lineară a sistemului HPLC/fluorescenţă. Dacă vârfurile pentru triptofan şi/sau pentru etalonul intern sunt prea joase sau prea înalte, analiza se repetă cu un eşantion de o altă dimensiune şi/sau un volum final modificat.

3.1.

Eter de petrol, interval de fierbere: 40-60 °C. Indicele de brom trebuie să fie mai mic de 1, iar reziduul după evaporare sub 2 mg/100 ml.

3.2.

Sulfat de sodiu, anhidru.

3.3.

Acid clorhidric, c = 3 mol/l

3.4.

Agent de filtrare, de exemplu Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.1.

Aparat de extracţie. Dacă este dotat cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului este astfel încât să producă aproximativ 10 cicluri pe oră; dacă aparatul este de tip fără sifon, rata refluxului este de aproximativ 10 ml pe minut.

4.2.

Cartuşe de extracţie, lipsite de materie solubilă în eter de petrol şi cu o porozitate compatibilă cu cerinţele de la punctul 4.1.

4.3.

Cuptor de uscare, fie cu vid reglat la 75 ± 3 °C, fie cu aer reglat la 100 ± 3 °C.

8.1.

Pentru produse cu un conţinut mare de uleiuri şi grăsimi, care sunt dificil de măcinat sau care sunt improprii prelevării unui eşantion de testare redus omogen, se procedează după cum urmează.

Se cântăresc 20 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se amestecă cu o cantitate de 10 g sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru (punctul 3.2). Se extrage cu eter de petrol (punctul 3.1) astfel cum se indică la punctul 5.1. Se completează extractul obţinut până la 500 ml cu eter de petrol (punctul 3.1) şi se amestecă. Se iau 50 ml de soluţie şi se introduc într-un vas mic, uscat şi cântărit, care conţine fragmente de piatră ponce. Se elimină solventul prin distilare, se usucă şi se procedează astfel cum se indică la ultimul paragraf al punctului 5.1.

Se elimină solventul din reziduul de extracţie rămas în cartuş, se macină reziduul până la o fineţe de 1 mm, se reintroduce în cartuşul de extracţie (nu se adaugă sulfat de sodiu) şi se procedează astfel cum se indică la punctul 5.1, paragrafele doi şi trei.

Conţinutul de uleiuri şi grăsimi se calculează ca procent din eşantion folosind următoarea formulă:

unde:

8.2.

Pentru anumite produse (de exemplu, cu conţinut mic de uleiuri şi grăsimi) masa eşantionului de testat se poate mări.

8.3.

Este posibil ca, înainte de hidroliză şi extracţie, hrana pentru animalele de companie cu conţinut mare de apă să trebuiască să fie amestecată cu sulfat de sodiu anhidru, conform procedurii B.

8.4.

La punctul 5.2, poate fi mai eficientă folosirea apei calde în locul apei reci pentru spălarea reziduului după filtrare.

8.5.

Este posibil ca timpul de uscare de 1,5 h să necesite a fi prelungit pentru unele furaje. Uscarea excesivă se evită, întrucât acest fapt poate determina rezultate slabe. Se poate folosi, de asemenea, un cuptor cu microunde.

3.1.

Acid sulfuric, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Agent antispumant (de exemplu n-octanol).

3.3.

Agent de filtrare (Celite 545 sau echivalent), încălzit la 500 °C timp de patru ore (8.6).

3.4.

Acetonă.

3.5.

Eter de petrol cu interval de fierbere între 40 şi 60 °C.

3.6.

Acid clorhidric, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 0,23 mol/l.

4.1.

Unitate de încălzire pentru dizolvare cu acid sulfuric şi soluţie de hidroxid de potasiu, echipată cu un suport pentru creuzetul filtrant (punctul 4.2) şi dotată cu un tub de evacuare prevăzut cu un dop la orificiul de ieşire pentru lichide şi de creare de vid, posibil şi cu aer comprimat. Înainte de fiecare utilizare zilnică, unitatea se preîncălzeşte cu apă aflată în stare de fierbere, timp de 5 minute.

4.2.

Creuzet filtrant de sticlă cu placă filtrantă de sticlă sinterizată fuzionată, cu pori de 40-90 m. Înainte de prima utilizare se încălzeşte la 500 °C timp de câteva minute, iar apoi se răceşte (8.6).

4.3.

Cilindru de cel puţin 270 ml cu condensator cu reflux, care poate fi supus fierberii.

4.4.

Cuptor de uscare, cu termostat.

4.5.

Cuptor cu muflă, cu termostat.

4.6.

Unitate de extracţie compusă dintr-o placă de sprijin pentru creuzetul filtrant (punctul 4.2) şi cu o ţeavă de evacuare prevăzută cu un dop la orificiul de creare de vid şi de ieşire a lichidelor.

4.7.

Inele de conectare utilizate pentru a asambla unitatea de încălzire (punctul 4.1), creuzetul (punctul 4.2) şi cilindrul (punctul 4.3), precum şi pentru a conecta unitatea de extracţie la rece (punctul 4.6) cu creuzetul.

m

=

greutatea eşantionului în g;

m0

=

pierderea de greutate după calcinare în cursul determinării, în g;

m1

=

pierderea de greutate după calcinare în cursul testului martor, în g.

9.1.

Furajele care au conţinut de grăsimi brute mai mare de 10 % trebuie să fie degresate înainte de a fi supuse analizei cu eter de petrol (punctul 3.5). Creuzetul filtrant (punctul 4.2) împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece (punctul 4.6) şi se creează vidul, apoi se spală reziduul cu trei porţii consecutive de eter de petrol de 30 ml, asigurându-se că reziduul este uscat. Creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de încălzire (punctul 4.1) şi se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.

9.2.

Furajele care conţin grăsimi care nu pot fi extrase direct cu eter de petrol (punctul 3.5) trebuie degresate astfel cum se indică la punctul 8.1 şi degresate încă o dată după fierbere cu acid. După fierbere cu acid şi spălare consecutivă, creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece (punctul 4.6), apoi se spală de trei ori cu 30 ml acetonă, urmat de trei spălări suplimentare cu porţii de eter de petrol de 30 ml. Se filtrează sub vid până la uscare, iar analizarea se continuă astfel cum se descrie la punctul 5, începând cu tratamentul cu hidroxid de potasiu.

9.3.

Dacă furajul conţine mai mult de 5 % carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu, se conectează creuzetul (punctul 4.2) împreună cu eşantionul cântărit la unitatea de încălzire (punctul 4.1). Eşantionul se spală de trei ori cu 30 ml acid clorhidric (punctul 3.6). După fiecare adăugare, se lasă eşantionul să stea timp de aproximativ un minut înainte de filtrare. Se spală o singură dată cu 30 ml apă, iar apoi se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.

9.4.

Dacă se utilizează aparatură în formă de stativ (o serie de creuzete ataşate la aceeaşi unitate de încălzire) nu se efectuează două determinări individuale pe acelaşi eşantion de analizat în aceeaşi serie.

9.5.

Dacă după fierbere este dificil să se filtreze soluţiile acide şi alcaline, se utilizează aer comprimat introdus prin ţeava de evacuare a unităţii de încălzire şi apoi se continuă filtrarea.

9.6.

Temperatura de calcinare nu depăşeşte 500 °C pentru a se putea prelungi timpul de utilizare a sticlei creuzetului filtrant. Trebuie acordată atenţie pentru a se evita şocurile termice excesive în cursul ciclurilor de încălzire şi răcire.

3.1.

Etanol, soluţie cu concentraţie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20 °C, neutralizată cu fenolftaleină.

3.2.

Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.

Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4 Fe (CN)6 3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.

Metiloranj, soluţie 0,1 % (greutate/volum).

3.5.

Acid clorhidric 4 mol/litru.

3.6.

Acid clorhidric 0,1 mol/litru.

3.7.

Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.

3.8.

Reactiv Luff-Schoorl:

Amestecând cu grijă, se toarnă soluţia de acid citric (punctul 3.8.2) în soluţia de carbonat de sodiu (punctul 3.8.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (punctul 3.8.1) şi se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează.

Se verifică concentraţia reactivului obţinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru), a se vedea (punctul 5.4) ultimul paragraf. pH-ul soluţiei este aproximativ 9,4.

3.8.1.

Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru, Cu SO4 5H2O, lipsită de fier, în 100 ml apă.

3.8.2.

Soluţie de acid citric: se dizolvă 50 g de acid citric, C6H8O7*H2O, în 50 ml de apă.

3.8.3.

Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.

3.9.

Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

3.10.

Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la 1 litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.

3.11.

Acid sulfuric 3 mol/litru.

3.12.

Iodură de potasiu, soluţie 30 % (greutate/volum).

3.13.

Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.

3.14.

3-metilbutan-1-ol.

7.1.

În cazul furajelor bogate în melase şi al altor furaje care nu sunt în mod particular omogene, se cântăresc 20 g şi se introduc, împreună cu 500 ml de apă, într-un balon gradat de 1 litru. Se amestecă timp de o oră în agitator. Se limpezeşte cu ajutorul soluţiilor reactiv Carrez I (punctul 3.2) şi II (punctul 3.3) astfel cum se descrie la punctul 5.1, utilizând, de data aceasta, o cantitate de patru ori mai mare din fiecare reactiv. Se completează până la volum cu etanol 80 % (v/v).

Se omogenizează şi se filtrează. Se elimină etanolul astfel cum se descrie la punctul 5.1. În absenţa amidonului dextrinizat, se completează până la volum cu apă distilată.

7.2.

În cazul melaselor şi al materiilor prime pentru furaje bogate în zaharuri şi cvasi lipsite de amidon (roşcove, fulgi de rădăcină de sfeclă uscaţi etc.), se cântăresc 5 g, se introduc într-un balon gradat de 250 ml, se adaugă 200 ml apă distilată şi se amestecă în agitator timp de o oră sau, dacă este necesar, mai mult. Se limpezeşte cu ajutorul soluţiilor reactiv Carrez I (punctul 3.2) şi II (punctul 3.3) astfel cum se descrie la punctul 5.1. Se completează până la volum cu apă rece, se omogenizează şi se filtrează. Pentru determinarea cantităţii totale de zaharuri, se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.3.

8.1.

În scopul prevenirii formării de spumă este recomandabil să se adauge (indiferent de volum) aproximativ 1 ml de 3-metilbutan-1-ol (punctul 3.14) înainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl.

8.2.

Diferenţa dintre conţinutul total de zaharuri după inversie exprimat ca glucoză şi conţinutul de zaharuri reductoare exprimat ca glucoză, multiplicată cu 0,95, reprezintă conţinutul procentual de zaharoză.

8.3.

Pentru a determina conţinutul de zaharuri reductoare, cu excepţia lactozei, se pot adopta două metode:

8.3.1.

Pentru un calcul aproximativ, conţinutul de lactoză stabilit printr-o metodă de analiză diferită se multiplică cu 0,675, iar rezultatul obţinut se scade din conţinutul de zaharuri reductoare.

8.3.2.

Pentru un calcul precis al zaharurilor reductoare, cu excepţia lactozei, se utilizează acelaşi eşantion în cele două determinări finale. Una dintre analize se efectuează pe o parte din soluţia obţinută în conformitate cu punctul 5.1, alta pe o parte din soluţia obţinută în cursul determinării lactozei prin metoda stabilită în acest sens (după fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri şi limpezire).

În ambele cazuri, cantitatea de zaharuri prezentă se determină prin metoda Luff-Schoorl şi se calculează în mg de glucoză. Una dintre valori se scade din cealaltă, iar diferenţa se exprimă ca procent din eşantion.

Exemplu

Cele două volume considerate corespund, pentru fiecare determinare, unui eşantion de 250 mg.

În primul caz, se consumă 17 ml de soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru, ceea ce corespunde la 44,2 mg de glucoză; în al doilea, 11 ml, ceea ce corespunde la 27,6 mg de glucoză.

Diferenţa este 16,6 mg de glucoză.

Prin urmare, conţinutul de zaharuri reductoare (cu excepţia lactozei), calculat ca glucoză, este:

Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2 S2 O3 0,1 mol/litru, 2 minute încălzire, 10 minute fierbere

3.1.

Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspendă 25 g de drojdie proaspătă în 100 ml de apă. Suspensia se păstrează în frigider o perioadă de maximum o săptămână.

3.2.

Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn (CH3 COO)2 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.

Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4 Fe (CN)6 3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.

Reactiv Luff-Schoorl:

Amestecând cu grijă, se toarnă soluţia de acid citric (punctul 3.4.2) în soluţia de carbonat de sodiu (punctul 3.4.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (punctul 3.4.1) şi se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează. Se verifică concentraţia reactivului obţinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru). pH-ul soluţiei este aproximativ 9,4.

3.4.1.

Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru, Cu SO4 5H2O, lipsită de fier, în 100 ml apă.

3.4.2.

Soluţie de acid citric: se dizolvă 50 g de acid citric, C6H8O7*H2O, în 50 ml de apă.

3.4.3.

Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.

3.5.

Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.

3.6.

Iodură de potasiu, soluţie 30 % (greutate/volum).

3.7.

Acid sulfuric 3 mol/litru.

3.8.

Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

3.9.

Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la 1 litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.

1.

Pentru produsele care conţin mai mult de 40 % zahăr fermentescibil, se utilizează mai mult de 5 ml de suspensie de drojdie (punctul 3.1).

2.

În hrana «cu conţinut redus de lactoză» (de exemplu, laptele pentru pisici), lactoza este convertită în fructoză, care nu este complet fermentată în decurs de două ore, ceea ce duce la rezultate pozitive mai mari sau false (deoarece reziduurile de fructoză rămân în extract).

Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2 S2 O3 0,1 mol/litru, două minute încălzire, 10 minute fierbere

3.1.

Acid clorhidric, soluţie cu concentraţie 25 % (g/g): 1,126 g/ml.

3.2.

Acid clorhidric, soluţie 1,13 % (greutate/volum)

Concentraţia se verifică prin titrare folosind o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenţa roşului de metil 0,1 % (greutate/volum) în etanol 94 % (v/v). Pentru neutralizarea a 10 ml sunt necesari 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru.

3.3.

Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn (CH3 COO)2 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.

Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4 Fe (CN)6 3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.5.

Etanol, soluţie cu concentraţie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20 °C.

4.1.

Flacon Erlenmeyer de 250 ml cu îmbinare de sticlă şlefuită standard şi cu condensator cu reflux.

4.2.

Polarimetru sau zaharimetru.

7.1.

În cazul în care eşantionul conţine mai mult de 6 % carbonaţi, calculaţi sub formă de carbonat de calciu, aceştia trebuie distruşi prin tratare cu o cantitate perfect adecvată de acid sulfuric diluat înaintea determinării rotaţiei optice totale.

7.2.

În cazul produselor cu un conţinut mare de lactoză, cum ar fi zerul praf sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează după adăugarea a 80 ml etanol (punctul 3.5). La balon se fixează un condensator cu reflux, iar balonul se scufundă într-o baie de apă la 50 °C timp de 30 de minute. Se lasă să se răcească şi se continuă analiza astfel cum se indică la punctul 5.3.

7.3.

În cazul în care sunt prezente în cantităţi semnificative în furaje, următoarele materii prime furajere sunt cunoscute ca dând naştere la interferenţe atunci când conţinutul de amidon se determină prin metoda polarimetrică şi, din acest motiv, se pot obţine rezultate incorecte:

- produse din sfeclă (de zahăr), precum pulpă de sfeclă (de zahăr), melasă de sfeclă (de zahăr), pulpă melasată de sfeclă (de zahăr), vinasă de sfeclă (de zahăr), zahăr (din sfeclă);

- pulpă de citrice;

- seminţe de in; şrot de seminţe de in; şrot de seminţe de in rezultat după extracţie;

- seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă rezultat după extracţie; coji de seminţe de rapiţă;

- seminţe de floarea soarelui; şrot de seminţe de floarea soarelui rezultat după extracţie; seminţe de floarea soarelui parţial decorticate, rezultate după extracţie;

- şrot de copra; şrot de copra rezultat după extracţie;

- pulpă de cartofi;

- drojdie deshidratată;

- produse bogate în inulină (de exemplu, fulgi şi făină de topinambur);

- jumări;

- produse din soia

În aceste cazuri, se poate aplica metoda de analiză prevăzută de Regulamentul (CE) nr. 121/2008 al Comisiei (⁷). Această metodă poate fi utilizată şi pentru furajele care conţin mai puţin de 1 % amidon.

(⁷)Regulamentul (CE) nr. 121/2008 al Comisiei din 11 februarie 2008 de stabilire a metodei de analiză pentru determinarea conţinutului de amidon din preparatele de tipul celor utilizate pentru hrana animalelor (cod NC 2309) (JO L 37, 12.2.2008, p. 3).

4.1.

Plită.

4.2.

Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.

4.3.

Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).

5.1.

Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550 °C. Se menţine la această temperatură până la obţinerea unei cenuşi albe, gri deschis sau roşiatice, aparent lipsită de particule carbonizate. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat.

5.2.

Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550 °C. Se calcinează timp de 3 ore. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat. Se calcinează din nou timp de 30 de minute pentru a asigura că greutatea cenuşii rămâne constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).

7.1.

Cenuşa substanţelor dificil de calcinat trebuie supusă unei calcinări iniţiale timp de cel puţin trei ore, urmată de răcire şi de adăugarea câtorva picături de soluţie de nitrat de amoniu 20 % sau de apă (cu grijă, pentru a evita dispersarea cenuşii şi formarea de aglomerări). Se continuă calcinarea după uscarea în cuptor. Operaţia se repetă până când calcinarea este completă.

7.2.

În cazul substanţelor rezistente la tratamentul descris la punctul 7.1, se procedează în felul următor: după calcinare timp de trei ore, se introduce cenuşa în apă caldă şi se filtrează printr-un filtru mic, lipsit de cenuşă. Filtrul şi conţinutul său se calcinează în creuzetul iniţial. Filtratul se introduce în creuzetul răcit, se evaporă până la uscare, se calcinează şi se cântăreşte.

7.3.

În cazul uleiurilor şi grăsimilor, se cântăresc cu precizie 25 g de eşantion într-un creuzet de dimensiuni adecvate. Se carbonizează prin aprinderea materialului cu ajutorul unei benzi de filtru de hârtie, lipsit de cenuşă. După combustie, se umectează cu cât mai puţină apă. Se usucă şi se calcinează astfel cum se descrie la punctul 5.

1.1.

Metoda A: aplicabilă materiilor prime furajere organice furaje şi majorităţii furajelor combinate;

1.2.

Metoda B: aplicabilă compuşilor şi amestecurilor minerale, precum furajelor combinate al căror conţinut de substanţe insolubile în acid clorhidric, determinat conform metodei A, este mai mare de 1 %.

2.1.

Metoda A: eşantionul se calcinează, cenuşa se fierbe în acid clorhidric, iar reziduul insolubil se filtrează şi se cântăreşte.

2.2.

Metoda B: eşantionul se tratează cu acid clorhidric. Soluţia se filtrează, reziduul se calcinează, iar cenuşa astfel obţinută se tratează conform metodei A.

3.1.

Acid clorhidric 3 mol/litru.

3.2.

Acid tricloracetic, soluţie 20 % (greutate/volum).

3.3.

Acid tricloracetic, soluţie 1 % (greutate/volum).

4.1.

Plită.

4.2.

Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.

4.3.

Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).

4.4.

Filtre lipsite de cenuşă

3.1.

Carbonat de calciu.

3.2.

Acid clorhidric, 20 = 1,10 g/ml (aproximativ 6 mol/litru).

3.3.

Acid azotic, 20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Acid azotic, 20 = 1,38-1,42 g/ml.

3.5.

Acid sulfuric, 20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Reactiv molibdovanadat: se amestecă 200 ml de soluţie de heptamolibdat de amoniu (punctul 3.6.1), 200 ml de soluţie de monovanadat de amoniu (punctul 3.6.2) şi 134 ml de acid azotic (punctul 3.4) într-un balon gradat de 1 litru. Se completează până la volum cu apă.

3.6.1.

Soluţie de heptamolibdat de amoniu: se dizolvă în apă fierbinte 100 g de heptamolibdat de amoniu (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Se adaugă 10 ml de amoniac (concentraţie 0,91 g/ml) şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.6.2.

Soluţie de monovanadat de amoniu: se dizolvă 2,35 g de monovanadat de amoniu NH4VO3 în 400 ml de apă fierbinte. Amestecând constant, se adaugă lent 20 ml de acid azotic diluat [7 ml de HNO3 (punctul 3.4) + 13 ml de H2O] şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.7.

Soluţie etalon de 1 mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387 g de fosfat diacid de potasiu KH2PO4 în apă. Se completează cu apă până la 1 litru.

4.1.

Creuzete pentru calcinare din silice, porţelan sau platină.

4.2.

Cuptor cu muflă electric, dotat cu termostat reglat la 550 °C.

4.3.

Flacon Kjeldahl de 250 ml.

4.4.

Baloane gradate şi pipete de precizie.

4.5.

Spectrofotometru.

4.6.

Eprubete cu diametru de aproximativ 16 mm, cu dopuri gradate la un diametru de 14,5 mm; capacitate: 25-30 ml.

3.1.

Soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/litru.

3.2.

Soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/litru.

3.3.

Soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Acid azotic, concentraţie: 1,38 g/ml.

3.5.

Eter dietilic.

3.6.

Acetonă.

3.7.

Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn (CH3COO)2·2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.8.

Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)6·3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.9.

Cărbune activ, lipsit de cloruri şi fără a le absorbi.

V1

=

ml de soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/l adăugată;

V2

=

ml de soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/l utilizată la titrare;

m

=

g din greutatea eşantionului în partea alicotă.

7.1.

Titrarea se poate face şi prin potenţiometrie sau amperometrie.

7.2.

În cazul produselor foarte bogate în uleiuri şi grăsimi, se procedează mai întâi la o degresare cu eter dietilic sau cu eter de petrol.

7.3.

În cazul făinii de peşte, titrarea se poate efectua prin metoda Mohr."

3.1.

Etanol, = 96 %

3.2.

Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 °C

3.3.

Metanol

3.4.

Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml

3.5.

Soluţie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la punctul 7.7)

3.6.

Sulfură de sodiu, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1.

Soluţie de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.8)

3.7.

Soluţie de fenolftaleină, c = 2 g/100 ml în etanol (punctul 3.1)

3.8.

2-propanol

3.9.

Fază mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (punctul 3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporţia exactă este determinată de caracteristicile coloanei folosite.

3.10.

Azot, lipsit de oxigen

3.11.

All-trans-vitamină A acetat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu, 2,80 × 106 UI/g

3.11.1.

Soluţie stoc de all-trans-vitamină A acetat: Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de vitamină A acetat (punctul 3.11) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (punctul 3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1 400 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.6.3.1.

3.12.

All-trans-vitamină A palmitat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu 1,80 × 106 UI/g

3.12.1.

Soluţie stoc de all-trans-vitamină A palmitat: Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 80 mg de vitamină A palmitat (punctul 3.12) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (punctul 3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1 400 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.6.3.2.

3.13.

2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.5)

4.1.

Evaporator rotativ cu vid

4.2.

Sticlărie laborator brună